作者：Xin Zhang, Xinlong Wang, Jie Lv, Hongxin Huang, Jiahong Wang, Ma Zhuo, Zhihong Tan, Guanjie Huang, Jiawei Liu, Yuchen Liu, Mengrao Li, Qixiao Lin, Lian Li, Shufeng Ma, Tao Huang, Ying Lin, Xiaoyang Zhao & Zhili Rong
CRISPR系统目前已经广泛用于各种物种的DNA和RNA编辑，并在基础研究以及临床转化中均展现巨大价值[1, 2]。然而常用的线性gRNA易被体内的核酸内切酶和外切酶降解，半衰期短，严重限制CRISPR系统的编辑效率[3]。
近日，南方医科大学荣知立教授、赵小阳教授和林瑛副教授课题组合作在Genome Biology发表题为Engineered circular guide RNAs boost CRISPR/Cas12a- and CRISPR/Cas13d-based DNA and RNA editing 的研究论文，发现环化可提高游离gRNA的稳定性，使得Cas12a和Cas13d自剪切环状gRNA组装出更多Cas12a/gRNA和Cas13d/gRNA功能复合体，从而提高DNA和RNA编辑效率[4]。
该研究采用先前报道的Tornado系统[5]，在gRNA序列的两侧连接Twister核酶（Ribozyme），该核酶可以快速自剪切形成特定的末端，并被细胞内普遍存在的RNA连接酶RtcB连接，产生环状gRNA（cgRNA）。为了避免核酶与CRISPR系统之间相互干扰，两者之间增加了特定的连接序列。研究结果显示cgRNA的稳定性以及其在细胞内的丰度均显著提高（图1）。
图1 环化提高gRNA的稳定性。a，gRNA环化的示意图。b，荧光染色显示细胞中gRNA的丰度。c，RT-PCR显示细胞中gRNA的环化情况。d，检测细胞中gRNA的半衰期。
为了探究cgRNA能否提高CRISPR系统的编辑效果，作者首先将其应用于Cas12a介导的DNA编辑（图2）。核酶和gRNA之间的连接序列对维持cgRNA的结构和功能至关重要，作者首先对连接序列的长度和组成进行了优化，通过RNAfold和mFold工具对随机生成的连接序列文库进行预测，再利用湿实验验证。在dCas12a介导的基因转录调控中，对多个位点以及多个细胞系综合统计显示，cgRNA的激活效果相比于线性gRNA提高了2.1-40.2倍，并且不影响其特异性。此外, cgRNA可与p300、VPR、SunTag-VP64、SunTag-VPR等多个激活系统兼容，具有普适性。作者进一步检测cgRNA能否增强Cas12a介导的DNA切割。研究发现，与线性gRNA相比，cgRNA将Cas12a切割活性提高约1.7-2.1倍，且具有较高的特异性。
图2 cgRNA增强Cas12a介导的DNA编辑。a，在dLbCas12a-p300敲入(KI)的 HEK293T细胞系中，cgRNA诱导内源性基因的激活。b，不同连接序列的筛选。c，在LbCas12a敲入的HEK293T细胞系中，cgRNA诱导14个内源性位点的切割。d-f，统计14个位点切割的效率和特异性。
随后，作者检测cgRNA能否增强Cas13d的RNA编辑效率。首先，在mNeonGreen荧光报告系统中对cgRNA的连接序列进行筛选，FACS分析显示，cgRNAs显著提高了RNA切割效率。随后，对于HEK293T细胞中的内源基因(STAT3, NF2, B4GALNT1, KRAS和RPL4)， cgRNA也更能有效地抑制其表达，约为1.2-2.8倍，且不影响其特异性和侧切活性 (图3)。
图3 cgRNA增强Cas13d介导的RNA编辑。a-b，RfxCas13d对mNeonGreen报告基因的RNA切割效率。c，RfxCas13d对内源基因的RNA切割效率。
CIRSPR系统的体内应用受到递送效率和编辑系统效率的限制，cgRNA的高稳定性可以增强编辑效率，在体内应用中具有独特的优势。为了进一步探究cgRNA介导的体内激活效果，作者构建了荧光素酶激活报告系统，并通过尾静脉水动力高压注射方法递送到小鼠肝脏。与体外实验结果相似，cgRNA在每个检测时间点的激活效果都优于线性gRNA，约为9.9 -32.6倍。最后，作者也探讨了cgRNA能否增强Cas12a的体内切割效果。由于KRAS、TP53和PTEN突变是肝内胆管癌的主要驱动因素[6]，作者利用LbCas12a-N57同时切割小鼠肝脏细胞Trp53和Pten基因，并将KrasG12D突变体插入小鼠Rosa26位点。研究结果显示，cgRNA组肿瘤结节更多，肝脏重量更大。提取部分肿瘤结节的基因组进行Sanger测序和TIDE分析显示，相比于线性gRNA，cgRNA组的Trp53和Pten位点具有更多的插入或缺失突变。这些结果均表明，在体内，cgRNA比线性gRNA能更有效地切割基因组DNA（图4）。
图4 cgRNA增强CRISPR系统的体内编辑。a-b，dLbCas12a-VPR激活小鼠肝脏荧光素酶的表达。c-e，LbCas12a-N57介导小鼠Trp53、 Pten和Rosa26位点的切割，诱导成年小鼠肝脏肿瘤。
总体而言，作者使用Tornado表达系统，生成了更稳定的cgRNA，显著提高了CRISPR的DNA和RNA编辑效率，小鼠体内实验也证明cgRNA显著优于线性gRNA。对于CRISPR系统的临床应用，体内递送通常是一个巨大的挑战，靶细胞摄取的基因编辑工具（核酸或者RNP）远小于体外或离体培养的细胞，而更稳定的cgRNA可以提高其在细胞内的丰度和持久性，在基因治疗方面具有很大的潜力。
南方医科大学附属东莞医院博士后张鑫和南方医科大学基础医学院肿瘤研究所博士生王新龙为该论文的共同第一作者，南方医科大学基础医学院肿瘤研究所/南方医科大学皮肤病医院荣知立教授、南方医科大学基础医学院发育生物学系赵小阳教授、南方医科大学基础医学院肿瘤研究所林瑛副教授为共同通讯作者。
参考文献：
Pickar-Oliver A, Gersbach CA: The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications.Nat Rev Mol Cell Biol 2019, 20:490-507.
Anzalone AV, Koblan LW, Liu DR: Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.Nat Biotechnol 2020, 38:824-844.
Ma H, Tu LC, Naseri A, Huisman M, Zhang S, Grunwald D, Pederson T: CRISPR-Cas9 nuclear dynamics and target recognition in living cells. J Cell Biol 2016, 214:529-537.
Zhang X, Wang X, Lv J, Huang H, Wang J, Zhuo M, Tan Z, Huang G, Liu J, Liu Y, et al: Engineered circular guide RNAs boost CRISPR/Cas12a- and CRISPR/Cas13d-based DNA and RNA editing. Genome Biology 2023.
Litke JL, Jaffrey SR: Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts.Nat Biotechnol 2019, 37:667-675.
Ma S, Wang X, Hu Y, Lv J, Liu C, Liao K, Guo X, Wang D, Lin Y, Rong Z: Enhancing site-specific DNA integration by a Cas9 nuclease fused with a DNA donor-binding domain.Nucleic Acids Res 2020, 48:10590-10601.
荣知立教授课题组主要研究方向为基因编辑技术开发以及利用小鼠模型、人源类器官和病人样本，研究肺和皮肤的再生医学。近5年以通讯作者在Nucleic Acids Res, Genome Biol, Nat Commun, Protein & Cell, Cell Rep, J Invest Dermatol等期刊发表论文20余篇，实验室长期招聘博士后，欢迎优秀博士生加入，有意者请将简历发送至rongzhili@smu.edu.cn
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