NBE | 南方科技大学张博/蒋兴宇/袁静等开发便携式、快速、准确和多用途的检测新冠病毒变体和谱系的方法

需要快速鉴定SARS-CoV-2谱系的便携式检测方法，以帮助大规模监测该病毒的演变。

2023年9月21日，南方科技大学张博、蒋兴宇、袁静、斯坦福大学戴宏杰及Nirmidas生物技术有限公司Tang Meijie 共同通讯在Nature Biomedical Engineering 在线发表题为“Multiplexed discrimination of SARS-CoV-2 variants via plasmonic-enhanced fluorescence in a portable and automated device”的研究论文，该研究报告了一种微阵列格式的多重检测方法，用于通过等温扩增和等离子体金增强近红外荧光检测SARS-CoV-2的变体。该方法具有变异识别的单核苷酸特异性、单RNA拷贝敏感性，不需要提取RNA，在刺突蛋白的3个突变热点中识别出12个SARS-CoV-2谱系，并在1034例鼻咽拭子中检测出该病毒，灵敏度为98.8%，特异性为100%，变异识别与基因组测序的一致性为97.6%。

该研究还报告了一种紧凑、便携、全自动的设备，集成了整个拭子到结果的工作流程，适用于SARS-CoV-2变体的即时检测。便携式、快速、准确和多用途的检测SARS-CoV-2变体和谱系的方法可促进变体监测工作。

在过去两年中，由SARS-CoV-2的传播引起的COVID-19大流行，截至2022年10月，已导致全球数十亿人感染，650多万人死亡。由于病毒的快速传播和频繁突变导致的SARS-CoV-2变异体和亚变异体的不断出现，改变了病毒的致病性、传染性、传播性和抗原性，全球传染病监测系统受到了挑战。迫切需要高通量、灵敏和多路的护理点技术，以便在大规模筛查期间快速检测SARS-CoV-2突变并鉴定病毒谱系。

作为监测SARS-CoV-2变异的主要方法，下一代测序(NGS)在对未知突变的全病毒基因组测序方面具有强大的功能。然而，NGS耗时(>3天)，需要专门的基础设施和专业人员，因此监测能力和地理覆盖范围有限。受限于有限的荧光通道，基于定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)的突变检测方法要么在试管中检测到一个带有野生型参比的突变，要么在没有相应野生型参比的试管中检测到多达4个突变，这可能导致假阳性，并且不适合变体监测。

CRISPR技术能够在给定的反应中检测1-3个靶标，已与微流体相结合，用于多重检测SARS-CoV-2变体；然而，它的设计可能很复杂，通常依赖于昂贵的设备。最近，一些具有即时诊断兼容性的SARS-CoV-2检测技术被报道出来，大大提高了诊断效率，拓宽了检测场景。然而，这些检测大多提供阳性/阴性结果，而不是区分SARS-CoV-2谱系，其灵敏度与qPCR相当。

荧光增强微阵列技术能够在一个反应中检测多个目标。近年来，研究人员一直致力于开发等离子体金(pGOLD)芯片，用于分析多路蛋白生物标志物，灵敏度低至飞摩尔。由于表面等离子体共振和局部电场增强效应，pGOLD底物可提供100倍以上的近红外(NIR)荧光增强，已用于基于抗体的I型糖尿病、寨卡病毒和SARS-CoV-2的诊断。然而，这项技术尚未用于核酸检测。

FEMMAN工作流程示意图（图源自Nature Biomedical Engineering ）

该研究报道了在pGOLD上多重病毒RNA检测的进展。该研究建立了一种快速、可扩展的方法，研究人员将其命名为荧光增强微阵列核酸多重分析(FEMMAN)，用于SARS-CoV-2的变异分化检测，适合大规模筛选。通过优化pGOLD芯片的荧光增强，该研究建立了一个简单的样品到结果的工作流程，其中复杂的RNA提取步骤被简单的热裂解所取代，不对称重组酶聚合酶扩增(RPA)用于直接探针杂交。FEMMAN通过探测S基因3个突变热点(G142-Y145、K417和L452)中的12个靶点，为12个SARS-CoV-2谱系(野生型、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Delta Plus、Lambda、Mu、Omicron BA.1、BA.2、BA.2.12.1和BA.5)提供高通量、快速和多路核酸检测，具有单分子灵敏度(扩增后)和单核苷酸变异(SNV)辨别。

重要的是，在802例SARS-CoV-2感染者的1034份临床样本中，该方法检测SARS-CoV-2的灵敏度达到98.8%，特异性达到100%，在变异鉴定中与测序的一致性达到97.6%。此外，该研究将FEMMAN与具有单轴凸轮轴设计的简单微流控芯片集成在一起，以实现完全自动化的裂解-扩增-杂交过程，并使用荧光采集系统直接测定SARS-CoV-2谱系。这种工具箱大小的拭子到结果装置应适用于SARS-CoV-2变体的即时监测。该检测可以很容易地扩展到检测新出现的SARS-CoV-2变体，并推广到检测其他病毒和变体。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01092-4

转自：“iNature”微信公众号

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