肿瘤内固体应力的活体测量揭示了长度尺度和微环境相关的力传递！
在癌症中，固体压力阻碍了向肿瘤提供治疗药物，阻碍了免疫细胞的运输和肿瘤渗透。要了解这种后果和固体压力的来源，需要在细胞尺度上对其进行体内探测。在这里，波士顿大学Hadi T. Nia报告了一种在体内进行固体应力的体积和纵向测量的方法，以及该方法对肿瘤的适用性。使用了注射到小鼠乳腺肿瘤中的荧光标记的聚丙烯酰胺珠的多模式活体显微镜，以及数学模型来比较单细胞和组织尺度上的固体应力，在原发和转移的肿瘤中，在体外和小鼠中，以及在活的小鼠和死后组织中。发现固体应力的传递是依赖于尺度的，肿瘤细胞承受的压力比它们的嵌入组织低，而肺转移瘤中的肿瘤细胞承受的固体应力比原发肿瘤中的高得多。固体应力对长度尺度和环境的依赖性可能会为使癌细胞对这种机械力敏感的治疗方法的发展提供信息。该研究以题为“Intravital measurements of solid stresses in tumours reveal length-scale and microenvironmentally dependent force transmission”的论文发表在《Nature Biomedical Engineering》上。
【原发性和转移性肿瘤体内固体应力测量系统的开发】
为了测量体内固体应力，该研究采用球形聚丙烯酰胺(PA)珠的活体成像作为固体应力传感器。PA珠具有生物相容性、可变形、尺寸和杨氏模量可调，并且适合核心和表面功能化，包括荧光团的共价连接。该研究使用反相乳液聚合法制备了荧光标记的PA微珠，并使用微米级的网目将它们过滤成所需的尺寸范围。在紫外线(UV)光灭菌后，PA小球被纤维连接蛋白功能化，以模拟PA小球与周围组织之间的细胞-基质相互作用，并促进PA小球对小鼠肿瘤的摄取。制备PA珠子用于组织尺度或细胞尺度的测量，以研究固体应力在长度尺度上的数量级变化的尺度依赖性。该研究实现了两个乳腺癌的同基因模型，MCA-M3C和E0771，用核定位的荧光蛋白H2B-Dendra2转导。将MCA-M3C-H2B-Dendra2 (MCA-M3C)或E0771-H2B-Dendra2 (E0771)细胞与细胞或组织规模的PA微珠原位联合注射到小鼠的乳房脂肪垫内治疗原发乳腺肿瘤。将MCA-M3C细胞与细胞尺度的PA珠尾静脉共同注射以诱导肺转移瘤。为了检查PA珠的存在是否影响肿瘤微环境，对肿瘤切片进行了苏木精-伊红(H&E)染色，与远离珠子的区域相比，PA珠周围没有明显的纤维化或炎症。
如果PA珠子太硬(超过0.77 kPa)，所产生的变形很小，不能量化肿瘤中固体应力的动态范围，如果珠子太软(低于0.2 kPa)，它们不会持续聚合，可能会因肿瘤中的固体应力而断裂或塑性变形。该研究发现，杨氏模数E=0.21±0.04 kPa(细胞尺度)和E=0.38±0.15 kPa(组织尺度)的PA微珠产生足够大的变形，可以分别在细胞尺度和组织尺度上被检测到，因此可以比具有较高杨氏模数的PA微珠更灵敏地检测固体应力水平。此外，具有较高长宽比的变形珠子具有较高的各向异性固体应力。
图1|原发性和转移性肿瘤体内固体应力测量的工作流程
【体内固体应力测量方法的验证和灵敏度分析】
使用可变形的PA微珠的活体显微镜，该研究在细胞和组织尺度上量化了体内小鼠肿瘤中PA微珠的纵横比和主要固体应力。该研究测量了将它们推入用于肿瘤注射的25G和23G针头(分别用于细胞和组织规模)后的珠长宽比。并试图确定变形是可塑性的(不可逆的)还是弹性的(可逆的)，以及珠子仍然完好无损还是破裂。结果表明，即使高度变形到长宽比约为4的PA微珠，也主要经历可逆和弹性变形。在2-3h内，组织中积累了5-7d的应力可以通过组织的酶解离来缓解。虽然在酶解更有效的体外球体中，珠子松弛至接近1的长宽比，但体内珠子并未完全松弛至精确的长宽比1，这可能是由于残留应力可能导致的。该研究在酶解后没有完全机械解离组织，以便在酶解过程中纵向跟踪珠子期间保持珠子的相对位置。在本研究的时间和长度范围内，粘弹性效应可以忽略不计，因为 PA 的松弛时间比酶解应力松弛的2-3小时要短得多(<2分钟)。因此，PA珠经历了剧烈但可逆的变形，表明该方法可用于灵敏地测量肿瘤中从~0.1 kPa到4 kPa的各种固体应力大小。
接下来研究了安乐死是否影响固体应力的测量。在细胞和组织尺度上，安乐死后60分钟内测量的固体应力密切反映了体内固体应力值。最后，优化并验证了我们的肿瘤诱导方法，以排除任何潜在的人为因素，例如窗户施加的人为压缩。结果表明没有观察到这两种肿瘤诱导方法中的固体应力之间存在任何显着差异，并得出结论，成像窗口下的肿瘤诱导不会改变肿瘤内固体应力。
图2|体内细胞和组织尺度固体应力测量的验证和灵敏度分析
【原发性乳腺肿瘤中固体应力的尺度依赖性传递】
肿瘤在不同长度尺度上具有异质的机械特性和结构。该研究使用体内固体应力测量方法来研究固体应力在两种小鼠乳腺肿瘤模型中是否与长度尺度相关。结果表明，在细胞尺度上，珠子组织尺度的珠子承受的应力范围较窄(0.004–0.574 kPa)，而组织尺度的珠子承受的应力范围更广且幅度更大(0.282–2.55 kPa)。通过使用珠子的原始变形几何形状能够捕获在细胞和组织尺度上经历的空间异质性的差异；因此，组织尺度的测量捕获了固体应力的异质性，而细胞尺度上经历的固体应力相对更加均匀。
图3|固体应力传递是尺度依赖性的：癌细胞在细胞尺度上经历的体内固体应力显着低于在组织尺度上经历的固体应力
【细胞尺度体内固体应力的纵向和空间测量】
肿瘤的机械特性随着肿瘤的生长而变化，并且在空间上变化。该研究的测量系统能够测量体内肿瘤的纵向和空间测量。展示了注射后6天内E0771肿瘤细胞尺度固体应力的纵向测量。固体应力和纵横比从第0天到第2天增加，从第2天到第6天达到稳定水平，表明细胞尺度的固体应力积累在肿瘤形成的前两天内迅速发生。该方法允许分别对细胞尺度和组织尺度应力进行长达7天和14天的纵向监测。窗口植入引起的肿瘤生长和纤维化导致珠子在成像深度之外变得模糊，并限制了PA珠子纵向成像所允许的时间范围，但我们表明窗口植入不会影响固体应力的测量。除了纵向测量之外，该系统还可以测量x、y和z位置的空间固体应力。该研究表明，在160μm范围内，固体应力不会随深度(z方向)变化。进一步表明，该方法能够绘制肿瘤中xy方向固体应力的异质性图。此外，该研究发现应力与纵横比具有线性关系，这表明，对于经历各向异性应力的珠子，纵横比提供了有关肿瘤中相对应力的信息。
图4|细胞尺度体内固体应力的纵向和空间测量
【肺转移中固体应力的细胞尺度测量】
该研究在肺泡压力为3和18 cmH2O时测量了肺肿瘤中PA珠的长宽比和应力，并将测得的应力与来自同一细胞系(MCa-M3C)的原发性肿瘤中的应力进行比较。结果表明癌细胞的组织环境显着影响癌细胞所经历的应激。此外，还研究了肺转移瘤中的应力是否因空间位置而变化。比较了肿瘤内、肿瘤周围和非肿瘤区域的珠子长宽比，结果表明，与非肿瘤和肿瘤内区域相比，肿瘤周围的长宽比明显更高。然而，肿瘤内和非肿瘤血管内区域的珠长宽比之间不存在显着差异。
图5 |测量功能正常的肺中乳腺癌肺转移的固体应力
【肺血管系统中单细胞经历的固体应力的测量】
癌细胞在到达转移部位之前通过脉管系统迁移，并在肺转移的早期阶段被捕获在毛细血管中。我们感兴趣的是量化毛细血管中癌细胞所经历的力。使用与循环细胞具有相似尺寸和材料特性的PA珠，使能够对癌症和免疫细胞在肺血管系统中经历的变形和应力进行数学建模。结果表明，即使在血管中变形时，PA珠对固体应力的变化也很敏感，这使得该方法可用于检测呼吸过程中脉管系统的周期性变化，以确定血管中细胞所经历的固体应力的变化。
图 6 |使用细胞级珠子作为单个细胞的替代物，测量单个细胞在血管中经历的固体应力
【体外3D癌症模型在细胞尺度上重现体内肿瘤固体应力】
肿瘤的球体和类器官模型在体外癌症模型中越来越受欢迎，因为它们比贴壁培养物更好地概括了肿瘤的3D结构和细胞组织。然而，尚不清楚它们是否忠实地再现了体内肿瘤微环境的生物物理学。为此，该研究使用固体应力测量方法来比较球体和体内肿瘤的固体应力。观察到球体中的固体应力与体内测量的固体应力没有显着差异。此外，细胞尺度的固体应力并不取决于球体的大小，这是由癌细胞的接种密度决定的。细胞在24-48小时内聚集形成的球体中的固体应力与在几天内基质募集形成的体内模型中的固体应力相似，这表明细胞与细胞的相互作用在发生过程中发挥了重要作用。固体应力的大小，并且固体应力的大小与多细胞聚集体中的细胞数量无关。
图 7 |肿瘤的体外模型模拟了体内细胞尺度的固体应力水平
【小结】
总之，该研究展示了原发性肿瘤和转移性肿瘤环境中肿瘤内固体应力的体内光学测量，其中保留了肿瘤微环境的复杂性。该研究的体内方法将为癌症研究人员提供多尺度工具，以更好地了解癌症的物理、生物学和免疫学的时空共同进化。固体应力传递具有尺度依赖性以及单个癌细胞所经历的固体应力远低于宏观尺度所经历的固体应力的发现，为肿瘤的机械适应提供了重要的见解。此外，还发现转移环境中的压力高于原发环境中的压力。这些发现可能为发现癌症和基质细胞可用来保护自身免受致命高固体应力的生物物理机制铺平道路，并为开发改变肿瘤中固体应力或增加肿瘤细胞对固体应力敏感性的治疗方法铺平道路。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41928-023-01023-w
来源：BioMed科技
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