细胞几何形状受到细胞骨架的影响，而细胞骨架受到整合素介导的细胞-细胞外基质（ECM）相互作用的调控。这之间的相互依赖性极大地影响着细胞的功能和命运。然而，传统细胞培养条件中细胞呈现不同形状、大小和取向，这为探索细胞形态与机械力的关系带来了挑战。近期，武汉大学刘郑教授团队提出了一种分子张力荧光显微镜与单细胞微图案结合的技术，能够表征具有规定几何形状的细胞的力学特性。研究发现曲率是细胞以膜张力和肌动蛋白依赖方式分化形状的关键几何线索并确定整合素β1在识别ECM几何信息的关键作用。该论文以“Exploring Mechanical Responses of Cells to Geometric Information using Micropatterned DNA-based Molecular Tension Probes”为题发表在近期ACS Nano杂志上。
制作修饰 DNA 张力探针的功能化微图案方法
为了实现微图案上细胞的机械力成像，该研究利用化学键相互作用通过微接触印刷将金纳米颗粒从PDMS转移到PEG钝化的玻璃基底上，随后在金纳米颗粒上修饰该团队前期报道的基于DNA结构的分子张力探针（Li H. Nat. Cell Biol. 2021, 23, 642-651）用于细胞力学成像。研究人员利用AFM、免疫染色以及TIRF成像等多种技术，验证了该方法的有效性。并对比了三种不同成纤维细胞的机械力特征，在传统非限制的生长环境下，这些细胞表现出相似的空间特征和力学强度分布，但在微图案上，三种细胞的力学结果存在明显差异。可见这一方法在可视化并定量细胞之间微妙的机械差异的潜力。
图一DNA分子张力探针图案化基底的制备和验证
细胞力学与几何学之间的关联
接着，研究人员探索了图案面积、形状与细胞机械力之间的关系。在圆形、三角形和正方形三种图案上，发现MEF细胞的黏着斑面积与细胞铺展面积成正比，56pN机械力强度与铺展面积成反比，暗示细胞通过降低黏着斑内56 pN的密度来实现更大的铺展面积。此外，MEF在圆形图案上的力学信号呈现各向同性的空间分布，而在三角形和正方形图案上，呈现处顶点分布的空间特征。这一结果说明细胞通过调节整合素张力分布以及力学信号密度来适应复杂的ECM形状，以保持稳定的黏着斑结构，从而促进细胞铺展。
图二图案几何形状与细胞机械力学的关系
局部曲率调节整合素作用力的大小和空间分布
由于这些图案为对称性形状，为了确认在三角形和正方形图案上的顶点分布是受到图案上尖端结构的全局还是局部影响，研究人员又设计了一系列非对称性图案进行验证。结果发现细胞的机械力依旧集中分布在图案上的顶点处，说明该影响是局部的。进一步发现，曲率作为定义局部几何形状的重要参数在细胞机械识别图案形状中发挥着至关重要的作用。细胞在曲率大的区域内力学信号密度较高，证实了细胞可以感知图案局部曲率变化来调节机械力的大小、密度以及空间分布。
图三微图案局部曲率对细胞力学性质的影响
膜张力和肌动蛋白调控整合素介导的粘附对几何形状的响应
膜张力与细胞形状密切相关，研究人员探究细胞机械响应ECM局部曲率过程中，膜张力是否参与其中的相互作用。结果发现降低细胞膜张力时，细胞骨架发生重排，图案上顶点空间分布特征被极大削弱或消失，与对照组相比，力学信号与图案形状之间的趋势也发生变化。有趣的是，增加细胞膜张力时，力学分布及力学信号均与对照组一样。这说明膜张力参与调控了整合素介导的图案识别过程。接着他们进行了能够干扰肌动球蛋白收缩力或肌动蛋白聚合的药物实验，发现MEF的机械力大小不仅发生明显下降，机械信号沿着图案边缘分布而非顶点分布。膜张力和肌动蛋白都可以调节整合素张力的空间特性，研究人员进一步探究这两种机械力的效应是否相互关联，实验中他们在改变膜张力的同时加入了上述药物。有趣的是膜张力降低时，这些药物的加入并未改变其空间分布，在细胞膜张力增加实验中，药物加入使力学信号显著减弱甚至消失。这些结果表明，整合素介导的细胞黏附力学因局部曲率产生的空间依赖性受到膜张力和肌球蛋白的独立影响。
图四膜张力和整合素介导的分子离合器对细胞对局部曲率的机械响应的调控
β1 整合素在感知 ECM 几何结构方面尤为重要
整合素作为连接胞内微丝骨架和胞外基质的重要桥梁，主要由α和β两种亚基组成的跨膜蛋白，是组成黏着斑以及传递机械力信号的关键蛋白。研究人员试图扰乱细胞-ECM 相互作用并观察微图案上细胞的机械特性。他们利用CRISPR/Cas9敲除并构建了αv (αv-KO MEF)和β1 (β1-KO MEF)两种细胞系，进行图案力学实验中发现，相比αv而言，β1整合素对细胞识别图案形状的机械响应影响更为显著。当β1敲除后，铺满图案的比例大幅度下降，力学信号密度与铺展面积的关系改变，空间分布也不局限于顶点处，图案的边缘和内部也聚集着大量的力学信号，进一步发现ARP2/3是β1介导的几何信息传导机制中的关键蛋白。
图五整合素亚αv和β1对细胞对微图案几何形状的机械响应的影响
综上，研究人员提出了一种结合分子张力荧光显微镜的单细胞微图案技术，可以用指定的几何形状来表征细胞的力学特征。其中面积和曲率是细胞识别ECM形状的重要几何因素，这一过程依赖于膜张力和肌球蛋白共同调控。此外，β1整合素的敲除可能会抑制ARP2/3的活性，导致膜特性混乱，进而影响到细胞的几何信息机械感知机制。本研究有望与多孔板集合提供细胞分子机械力统一化的测量平台，高通量筛查表现异常机械力的病变细胞以及细胞机械力学的药物筛选。
参考文献：
Li, H. Y.; Zhang, C.; Hu, Y. R.; Liu, P. X.; Sun, F.; Chen, W.; Zhang, X. H.; Ma, J.; Wang, W. X.; Wang, L.; et al. A reversible shearing DNA probe for visualizing mechanically strong receptors in living cells. Nat. Cell Biol. 2021, 23 (6), 642−651.
作者信息：武汉大学高等研究院博士生孙凤为第一作者，刘郑教授和陈伟博士后为通讯作者，该研究受到国家自然科学基金和湖北省博士后基金的共同资助。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/epdf/10.1021/acsnano.3c07088
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