NC | tgCRISPRi：使用截短型gRNA和具催化活性的Cas9实现高效基因敲低

CRISPRi是一种在哺乳动物细胞中沉默基因的高效方法，它使用酶失活形式的Cas9 (dCas9)与一个或多个与靶基因转录起始位点互补的20个核苷酸(nt)的引导RNA (gRNAs)结合。通过这样的gRNA/ dCas9复合物与DNA结合，阻碍目标位点的转录。相关研究表明，当gRNA被截短（tgRNA），靶向≤16 nt的序列时，其保留了将Cas9与特定基因组DNA靶标结合的能力，但不会导致DNA切割。鉴于其固有的简单性和多功能性，使用活性Cas9来维持基因编辑（使用常规gRNA）和调控基因表达（使用tgRNA）的未充分利用的替代策略值得进一步评估。

2023年9月11日，Auradkar等人在国际著名学术期刊Nature communications发表了题为“tgCRISPRi: efficient gene knock-down using truncated gRNAs and catalytically active Cas9”的研究文章。在该研究中，作者设计了一个基于14-16nt互补的tgRNA和活性Cas9的CRISPRi系统，提出了一种替代的基因抑制策略。当Cas9/tgRNA复合物结合到特定的靶点时，不触发DNA切割。

作者测试了针对几个果蝇基因座的tgRNAs，发现它们可以有效地沉默基因表达。当靶向转录起始位点附近时，这些短的14-15 nts tgRNAs，与将dCas9结合全长gRNAs一样有效地抑制了黑腹果蝇体细胞组织中几个靶基因的表达，产生的表型类似于使用全长gRNAs进行活性Cas9切割和突变靶基因所获得的表型。

该研究还表明，tgRNA可以在激活模式(即CRISPRa)中使用，当tgRNA与Cas9-VPR融合蛋白结合或调节增强子活性时，tgRNA也可以激活靶基因的表达。因此，本研究验证了截短的gRNA CRISPR干扰系统(tgCRISPRi)在果蝇体内的有效性。

当被限制同时使用一种活性形式的Cas9时，这种双重作用系统具有特别的优势，例如基于CRISPR的基因驱动系统。考虑到这一重要的应用，作者提供了将tgCRISPR技术纳入基因驱动的原理证明，其中全长gRNA促进基因驱动元件的复制，而tgRNA调节特定基因的表达。作者还讨论了tgRNA如何通过在不同的基因编辑应用中启用多个并行基因编辑和基因调节功能来扩展CRISPR应用的范围。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40836-3

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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