肠缺血再灌注损伤 (Ischemia/Reperfusion, I/R)常见于严重创伤、休克、感染、绞窄性肠梗阻、急性肠系膜缺血及体外循环等多种临床情况。如果及早治疗，急性肠缺血通常可以逆转，延误诊断则会导致多器官功能不全甚至衰竭，死亡率极高。然而目前，由于患者临床表现模糊且缺乏早期特异性诊断生物标志物，肠 I/R 损伤早期诊断十分困难。常用的肠损伤诊断标志物包括肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、二胺氧化酶 (DAO)、谷胱甘肽 S 转移酶、瓜氨酸、平滑肌蛋白（SM22）等。I-FABP 在肠粘膜上皮细胞损伤后被释放到循环中，目前被认为是早期识别肠缺血和损伤的一个较敏感的标志物。然而，I-FABP 水平在其他类型的小肠疾病中也会升高，如急性小肠结肠炎、克罗恩病和单纯性肠梗阻，影响了其特异性[1]。SM22能够及时检测肠肌层严重的缺血性损害，而不能及时发现早期肠粘膜损伤[2]。总体而言，现有的血清、尿液及组织中的标志物诊断效能依然较低，迫切需要寻找更加敏感和更具肠道特异性的肠损伤标志物。
肠 I/R 肠损伤的机制目前尚未阐明，我们研究团队及他人研究表明，肠 I/R 引起的肠损伤与缺血缺氧导致能量生成减少，进而大量钙离子进入细胞诱导细胞膜损伤有关[3]。细胞受损时释放的炎性介质又进一步触发炎症反应，导致大量的白细胞黏附及释放、活性氧自由基堆积、补体激活，从而进一步加重细胞凋亡、坏死等[4]。根据肠 I/R 损伤机理，目前的治疗策略如抑制炎症反应、改善免疫微环境以及缺血预处理等，均有一定的保护效果[5-6]。然而，由于目前仍缺乏针对肠粘膜上皮损伤的可调控靶点，以上防治方法依然不能有效降低肠 I/R导致的不良后果。因此，阐明肠 I/R 发生发展的新机制，开发针对肠 I/R 肠粘膜上皮损伤的创新治疗策略至关重要。
2023年9月6日，南方医科大学南方医院麻醉科刘克玄教授团队在Nature Communications 杂志在线发表了题为“Exosomal circEZH2_005, an intestinal injury biomarker, alleviates intestinal ischemia/reperfusion injury by mediating Gprc5a signaling”的工作。该研究揭示了血浆外泌体circEZH2_005有望作为肠I/R肠损伤敏感及特异的诊断生物标志物，而且提出靶向circEZH2_005/hnRNPA 1/Gprc5a信号轴可能是肠I/R损伤的潜在治疗策略。
在本研究中，研究人员首先通过超高速离心及密度梯度离心方法提取了肠I/R小鼠肠组织外泌体（图1a-c），接着通过circRNA高通量测序技术鉴定了肠I/R小鼠肠组织外泌体circRNA表达谱 （图1d-f）。进一步在小鼠肠组织、肠组织外泌体、血浆外泌体中筛选验证发现circEZH2_005在肠I/R后的肠组织外泌体及血浆外泌体中表达降低，且其表达与肠损伤严重程度呈负相关（图1g, h）。这一发现支持将血浆外泌体circEZH2_005作为肠I/R肠损伤诊断标志物的可能性。
图1. 外泌体circEZH2_005表达与I/R诱导的肠损伤相关
接着，研究人员发现circEZH2_005在人和小鼠之间具有高度同源性，因此该团队采用接受体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)心脏手术患者的血浆标本进行临床验证。结果如图2所示：在39例术后发生胃肠功能障碍的患者中，血浆外泌体circEZH2_005的表达在手术后即刻降低，在再灌注后6小时达到峰值，并且circEZH2_005的表达水平与I-FABP及D-Lactate的表达呈负相关（图2a, f, g）。进一步通过制作ROC曲线发现，血浆外泌体circEZH2_005能够良好的区分术后发生肠损伤的患者，其曲线下面积（AUC）值为0.732，当其与肠损伤现有标志物IFABP进行联合诊断时，诊断效能提高至0.846，反映了良好的临床应用价值（图2d）。此外，circEZH2_005的表达和肠损伤AGI评分呈负相关（图2h）。这些数据提示外泌体circEZH2_005可能是术后诊断肠损伤的潜在生物标志物。
图2. 外泌体circEZH2_005在体外循环术后患者血浆中的表达
此外，研究者进一步检测circEZH2_005的组织器官表达特异性，发现circEZH2_005在小鼠肠组织中的表达均高于肝、肾、脑和肺组织（图3b）。同时FISH检测circEZH2_005在肠组织中的定位情况，发现circEZH2_005主要表达于肠隠窝细胞，与Lgr5+隐窝干细胞具有明显共定位，且随着肠损伤的加重circEZH2_005在肠隠窝干细胞中的表达显著降低（图3e-g），此结果提示circEZH2_005可能在肠I/R肠隠窝干细胞损伤修复中发挥重要的功能。
图3. circEZH2_005在肠组织中的表达及定位
进一步，该团队采用小鼠肠I/R在体模型和小肠类器官离体模型探讨了circEZH2_005在肠I/R中的作用，发现circEZH2_005可以促进H/R损伤后的小肠隐窝干细胞的增殖（图4）。此外过表达circEZH2_005明显减轻I/R诱导的肠绒毛高度和隐窝深度的降低，逆转了I/R诱导的肠隠窝干细胞数量的减少（图5）。这些结果表明circEZH2_005可以通过促进小肠隐窝干细胞的增殖来修复肠道I/R损伤。
图4.circEZH2_005在体外可保护肠道类器官免受H/R损伤
图5. circEZH2_005改善体内I/R诱导的肠I/R损伤
最后，为了探索circEZH2_005调控肠隐窝干细胞的潜在机制，研究人员通过RNA pull-down和蛋白质组学分析鉴定了与circEZH2_005特异性相互作用的蛋白（图6a,b）。数据库预测分析和RIP实验证实了hnRNPA1是circEZH2_005的RBP候选蛋白（图6c,d）。此外，当hnRNPA1响应I/R刺激定位于细胞核时，可观察到circEZH2_005对hnRNPA1的调节作用。circEZH2_005的敲低降低了hnRNPA1的细胞质水平，而circEZH2_005过表达促进了hnRNPA1蛋白从细胞核向细胞质的输出（图6e,f）。进一步的实验显示，hnRNPA1的RNA识别基序2（RRM2）结构域是circEZH2_005结合所必需的，且hnRNPA1是与circEZH2_005的171 -252nt片段结合（图6h-i）。
图6. HnRNPA1与隐窝干细胞中的circEZH2_005结合并促进其细胞质易位
由于hnRNPA1在调控mRNA合成、稳定性和翻译中起关键作用。因此，研究人员通过RNA转录组测序来评估过表达circEZH2_005的肠隐窝细胞（图7a,b）。结果发现Gprc5a上调最明显，且预测与hnRNPA1结合（图7c,g）。沉默Gprc5a加重了类器官H/R损伤，在功能上消除了circEZH2_005对H/R损伤的类器官保护作用（图7e,f）。进一步的RIP实验证实了hnRNPA1与Gprc5a mRNA结合，并且沉默hnRNPA1降低了Gprc5a mRNA的稳定性（图7h）。此外，研究发现circEZH2_005敲低或过表达可降低或增加Gprc5a mRNA与hnRNPA1的结合（图7j,k）。另外，circEZH2_005可调节Gprc5a mRNA的稳定性，这种作用可被hnRNPA1逆转（图7i）。这些结果表明circEZH2_005通过与hnRNPA1结合提高Gprc5a的稳定性，从而促进肠I/R损伤期间ISC的增殖。
图7. CircEZH2_005通过稳定Gprc5a预防肠道I/R损伤
综上所述，研究人员综合利用肠I/R动物模型、体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)心脏手术临床模型、小肠类器官H/R模型和分子生物学等技术手段，揭示了一个与肠I/R肠损伤相关的外泌体circRNA分子 circEZH2_005，证实了外泌体 circEZH2_005可以有效地区分术后肠I/R肠损伤患者和非肠损伤患者。circEZH2_005在小肠隠窝干细胞中高表达，通过与hnRNPA1直接相互作用增强缺氧诱导相关蛋白Gprc5a的稳定性促进隐窝干细胞增殖，从而减轻I/R诱导的肠粘膜损伤（图8）。因此，该研究不仅为肠I/R肠道损伤的早期检测提供了一种有希望的非侵入性生物标志物，而且为防止肠I/R损伤的治疗策略开辟了一条新途径。
图8 circEZH2_005保护肠I/R肠损伤的分子机制示意图
南方医院麻醉科张文娟博士和周柏伟博士后为论文共同第一作者，刘克玄教授和李偲教授为论文通讯作者。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-41147-3
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