近日，Protein & Cell发表了黄荷凤院士团队的最新研究成果“Biallelic variants in RBM42 cause a multisystem disorder with neurological, facial, cardiac, and musculoskeletal involvement（RBM42双等位基因变异导致神经、面容、心脏和肌肉骨骼的多系统异常）”。本研究基于临床获得的罕见病例，通过家系全外显子组测序，发现RBM42可能是常染色体隐性遗传神经发育障碍综合征的新致病基因。在此基础上，利用细胞、真菌和小鼠模型，研究基因型与表型的相关性。本研究首次将RBM42基因与人类具体疾病相关联，为进一步了解RNA结合基序蛋白的生物学意义奠定基础，并为相关疾病诊断和治疗提供理论依据。
神经发育障碍 (neurodevelopmental disorders, NDDs) 是一种常见的出生缺陷，表现为大脑发育或功能受损，影响认知、语言、情感和运动等正常发育，全球有超过3%的儿童受累。常见的NDDs包括智力障碍、注意力缺陷/多动症、自闭症谱系障碍和癫痫等。该综合征的诊断一般是通过临床表现结合基因检测。测序方法包括全外显子组测序，Sanger测序等。作为常染色体显性遗传病，健康父母生出患儿的风险很小。然而，由于生殖系嵌合现象，即精子细胞前体具有突变而其他则没有，健康父母仍有大约1 %的可能性生出患儿。治疗的重点是对症处理。心房或室间隔缺损通常通过观察治疗，但在严重的情况下可以通过手术矫正。运动和语言技能通常会随着患者年龄的增长而提高，一些患者已经能够使用手语或辅助语言设备来促进交流。该疾病的预后尚不完全清楚。少数患者因泌尿系统缺陷引起的并发症而在婴儿期死亡，包括Okamoto的前两名患者的感染，但大多数患者都经历了童年和青春期。由于缺乏成年患者，成年后的预后尚不清楚。
大部分NDDs 是综合征性疾病，除神经系统症状外，还累及其它系统，尚缺乏有效的治疗手段，严重影响患者的生存和生活质量，给家庭和社会造成巨大负担。早期的筛查和诊断对NDDs 的预防控制有重要的科学价值和社会意义。高通量测序技术可以检测到基因组中绝大多数重要变异，也为NDDs 的分子诊断和寻找新的致病基因提供了有效的方法。然而，NDDs 具有高度的遗传异质性，目前仍有超过一半的NDDs 患者未找到明确的遗传学病因。
本课题组长期致力于出生缺陷相关的遗传学诊断及机制研究工作。前期工作中，我们通过全外显子组测序，在以中枢神经系统异常、特殊面容、先天性心脏病、严重发育迟缓等异常为特征的罕见病例中发现RBM42 可能是一个新的常染色体隐性遗传神经发育障碍综合征的致病基因。
图1 先证者的临床表现
经过对先证者进行染色体核型分析、染色体微阵列检测和线粒体测序，结果均为阴性。行家系全外显子组检测时，在已经的致病基因里亦未发现可疑的致病位点，但数据再分析时发现先证者存在高度可疑致病变异：NM_024321.5(RBM42):c.[304C>T];[1312G>A], p.[(Arg102*)];[(Ala438Thr)]。RBM42基因编码RNA 结合基序蛋白42，是一个重要的剪接调控因子，在人体中广泛表达。目前，对RBM42 基因的研究尚少，其参与疾病的作用机制尚不明确。但是，已有研究表明RBM42与引起Au-Kline 综合征的HNRNPK 基因关系密切。
HNRNPK基因致病性变异引起的Au-Kline 综合征以常染色体显性方式遗传，主要表现为全面发育迟缓，张力减退，智力障碍，存在可变的自主神经功能障碍，大多数患者存在先天性心脏病，灰质异位，胼胝体发育不全等。典型的面部特征包括长睑裂，上睑下垂，浅眼眶，耳突出，耳廓异常，宽鼻翼，舌中线深和下垂嘴。其它异常包括颅缝早闭，喂养困难，视力问题，听力障碍，肾积水，腭异常，少牙等。多学科会诊认为RBM42 突变患者表型与Au-Kline综合征高度重叠，可归为Au-Kline综合征的一种亚型。
本研究首先建立了患者家系的LCLs细胞系，发现先证者的RBM42 mRNA和蛋白表达水平均比其父母低。293T的过表达实验证实，R102*突变导致了无义介导的RNA降解，无最终蛋白产物，A438T突变的表达量也比野生型低。Co-IP实验进一步证实A438T突变影响了RBM42与HNRNPK的结合。免疫荧光结果说明，突变虽然影响了RBM42的表达，但未改变其与HNRNPK在细胞内的定位。（图2）
图2 野生型和突变型RBM42在不同细胞系中的表达情况
之前已有研究表明，人类RBM42是引起小麦赤霉病的禾谷镰刀菌中pre-mRNA 剪接调节因子FgRbp1 的直系同源物，能够完全弥补ΔFgRbp1引起的生长缺陷。因此，在此基础上，本研究构建了突变型的回补载体，转化ΔFgRbp1缺陷型禾谷镰刀菌，观察菌丝的生长情况。结果发现，ΔFgRbp1::RBM42R102*菌株生长情况与ΔFgRbp1菌株相似，约40%的ΔFgRbp1::RBM42A438T菌株能回复到与野生型相似的生长情况。禾谷镰刀菌的回补实验证实R102*是无效变异，A438T是亚效变异。
图3 禾谷镰刀菌的回补实验
本研究还利用CRISPR/Cas9技术对单倍体细胞进行基因编辑，基于单倍体精子快速获得了突变小鼠模型。双突变小鼠生长发育严重受限，且胚胎致死。进一步对E9.5的小鼠胚胎进行了RNA-seq分析，发现变异影响了小鼠神经、心脏发育相关基因的表达和剪接，与患者的主要表型相符，也应证了RBM42主要是通过影响重要的可变剪接事件，进而影响胚胎的正常发育。
图4 小鼠模型和部分RNA-seq结果
本研究初步证实RBM42是一个新的神经发育障碍综合征致病基因。临床评估、遗传分析、细胞功能实验和突变模型研究的结果支持RBM42通过影响选择性剪接，在维持胚胎发育所需的正常细胞生长方面发挥重要作用。
来源：复旦大学
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37294900/
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