小盟今天分享的文章是北京大学第一医院团队在2023年9月发表于《Kidney Int.》（IF 19.6/Q1）题目为MTMR3 risk alleles enhance Toll Like Receptor 9-induced IgA immunity in IgA nephropathyMTMR3风险等位基因增强IgA肾病中Toll样受体9诱导的IgA免疫。
方法
（1）研究参与者
为了测试基因与IgAN易感性的相关性，2762名活检诊断为IgAN的患者和5803名健康对照被纳入作者的研究。在肾活检时，2310例IgAN患者的血清IgA水平可用。IgAN的诊断是基于系膜区存在显性IgA沉积，通过免疫荧光显微镜确定并通过电子显微镜确认。排除系统性红斑狼疮、肝硬化、过敏性紫癜和其他自身免疫性疾病。
（2）基因分型、质量控制和插补
关联分析扩展到包括MTMR3、HORMAD2、LIF和OSM在内的基因的大LD片段（chr22:30079157-30773062，hg19）。作者的研究集中在MTMR3和HORMAD2上游或下游200kb范围内的变体上，产生了w700kb的感兴趣区域。使用Human 610 Quad（1171例和891例对照）、OmniZhongHua-8芯片（479例和3672例对照）和Global Screening Array（1112例和1240例对照；Illumina）进行基因分型。如前所述，作者对每个队列进行了严格的质量控制分析。排除了low call rates（<95%）的样本进行进一步分析。
根据性染色体标记的分析，估算每个个体的性别，排除性别不匹配的个体。使用PLINK版本（v）1.9检验了各州成对身份方面的潜在遗传相关性。作者使用基于主成分分析的方法来检测群体异常值和分层。如果SNPs的call rates＜95%，次要等位基因频率＜0.01，或显著偏离Hardy-Weinberg平衡，则将其排除在外（P＜10-4）。使用Michigan imputation Server 1.0.2.20 T版，在每个队列中独立进行基因型插补。
（3）关联和条件分析
假设加性效应，使用PLINK v1.9中实施的逻辑回归模型评估MTMR3/HORMAD2/LIF/OSM区域中每个变体与IgAN的相关性。为了测试变异与血清IgA水平之间的相关性，作者使用PLINK v1.9中实施的加性效应线性模型，使用标准化为平均值0和标准差1的IgA数据，并根据年龄和性别进行调整。随后，使用逆方差加权荟萃分析（METAL软件）将不同队列的结果进行组合。
使用来自完整的研究study-level 荟萃分析。使用Cochran Q统计检验研究之间的异质性。
在确定rs4823074是与IgAN最密切相关的变体后，使用rs4823074-基因型作为模型协变量，使用每个队列中的主要基因型数据。使用Bonferroni校正的P值阈值对1530项3.27×10–5的独立测试进行统计学显著性评估。全基因组显著性阈值设定在P¼5.0×10–8的水平。LocusZoom23用于提供结果的区域可视化。
（4）功能注释
基于Roadmap表观基因组和来自国家人类基因组研究所DNA元件百科全书（ENCODE）的数据，使用HaploReg v4.1对非编码变体进行注释。作者通过查询基因组聚集数据库（gnomAD）调查了MTMR3基因的功能缺失变体。ClinVar用于检测序列变异和人类表型之间的关系。作者通过查询QTLbase数据库，测试了不同组织/细胞类型中以每个SNP为中心的10Mb区域内的表达数量性状基因座（eQTL）效应。作者通过查询eQTLGen Consortium数据调查了血液eQTL效应，这是一项对31684人血液样本进行的荟萃分析。从人类肾脏eQTL图谱中获得659个显微切割的人类肾脏样本（356个小管和303个肾小球）中鉴定的人类肾脏eQTL效应。作者使用GTEx v8的IGV浏览器来可视化组织特异性eQTL数据。来自GM12878（一种B淋巴细胞样细胞系）的启动子捕获Hi-C数据用于识别与指数变体相互作用的基因，如在3D基因组浏览器中实现的。通过查询3302个独特性状的4756个公开可用的GWAS，在GWAS ATLAS33中可视化PheWAS图。
（5）孟德尔随机化分析
为了优先考虑具有潜在疾病易感性表达的假定致病基因，作者使用了基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR）方法和全血中的eQTL数据。为了探讨血清IgA水平与IgAN易感性之间的因果关系，作者使用在作者的队列中进行的关联分析的汇总数据进行了2样本孟德尔随机化（2SMR）分析。
（6）共定位分析
为了估计血清IgA水平和IgAN易感性之间共享相同遗传变异的后验概率，作者使用在作者的队列中进行的关联分析的汇总数据进行了共定位分析。使用R coloc包（R Foundation）中的coloc.abf函数计算贝叶斯后验概率，并使用默认参数。H4系数表明了这两个性状共享一个因果变异的概率。当共定位的后验概率大于0.8（PP.abf>0.8）时，作者认为信号显著共定位。作者使用R包生成了共定位图locoscomparer。
（7）细胞培养和刺激
DAKIKI细胞从美国典型培养物保藏中心获得，并在补充有10%胎牛血清和1%链霉素/青霉素的罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640培养基中培养。
（8）动物研究
年龄和性别匹配的C57BL/6J野生型小鼠和Mtmr3敲除小鼠购自Gempharmacatech Co.。
将小鼠维持在无特定病原体的条件下，并在10周龄时使用。ODN 2395是一种对人/小鼠TLR9.41特异性的强B细胞激活剂。ODN 2391（5-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3）和ODN 2395-对照（5-tgctgcttggcccccccc-3）购自InvivoGen。小鼠腹膜内注射磷酸盐缓冲盐水、CpG ODN（ODN 2395，250mg/ml）或CpG对照（ODN 239 5，250m/ml），体积为200ml，每周3次，持续12周。使用酶联免疫吸附测定法（补充方法）测量小鼠血清中的IgA、IgG、IgM和IgA-IgG复合物。肾标本进行免疫荧光染色、组织病理学和流式细胞术分析。
（9）RNA测序分析
使用TRIzol试剂提取每个样品的总RNA。在Illumina NovaSeq6000平台上对文库进行测序，以生成150个碱基对的成对末端读数。
主要结果
1.3种GWAS的荟萃分析确定IgAN的风险变异
作者系统地检查了所有常见的SNPs（次要等位基因频率＞0.01）包含包含MTMR3、HOR MAD2、LIF和OSM的基因集（chr22:30079157-30773062，hg19）。经过质量筛选后，作者的分析共包括8565名参与者（2762例IgAN病例和5803例对照；以及该地区的1530个变体。作者在组合样本集中观察到群体分层的最小影响（l¼1.029）。与先前的GWAS一致，作者还在该区域检测到一个全基因组显著信号，由rs4823074表示（比值比[OR]¼1.29，P¼1.84×1010；图1a；表1）。作者能够在所有队列中复制这种关联。先前报道的变体rs24129717和rs125376在作者的队列中也显示出显著的相关性（OR¼1.29，P¼3.10 10×1010和OR¼1.234，P¼分别为1.99×1010）。最高的SNP rs4823074与rs2412971（D0¼1.00，r2¼0.98）和rs12537（D0 1/4 0.97，r2 1/4 0.54）处于强LD中，对rs4823075的调节消除了rs2412970（Pconditioned¼1.00）和rs125 37（Pcondition¼0.87）处的关联。
在初步分析中，作者确定了一个关联信号在该区域的rs16988135（OR¼1.41，P¼1.62×10–6），在Bonferroni校正后达到显著性阈值（区域P阈值¼3.27×10–5；1530次Q22测试为0.05；表1）。变体rs16988135处于弱LD中，rs4823074（r2¼0.08）、rs2412971（r2¼0.8）和rs12537（r2¼0.05）。对rs4823074作用的进一步调节部分消除了这种关联的证据（ORconditioned¼1.30，Pconditioned 1/4 2.80 10-4；图1b和图c），然而，它没有通过Bonferroni校正进行多重测试。
图1
2.eQTL和不同策略的基因表达分析表明MTMR3可能是候选基因
顶部信号rs4823074是HOR MAD2的内含子变体，编码含有HORMA结构域的蛋白质2，一种在减数分裂前期参与突触监视的保守蛋白。SNP rs16988135位于MTMR3的5 UTR中。MTMR3编码肌微管蛋白家族的一个成员，其具有磷酸肌醇3-蛋白酪氨酸磷酸酶活性。
作者用rs4823074注释了LD中的所有SNP（r2>0.6）或rs16988135，未发现编码变体。然后，作者查询QTLbase，这是一个包含70多种组织/细胞类型的全基因组eQTL汇总统计数据的数据库，以缩小潜在靶基因的数量。在以每个SNP为中心的10Mb区域内，作者注意到rs4823074和rs16988135在不同组织中对MTMR3施加顺式eQTL效应（图2a）。
MTMR3在全血中强烈表达，包括在不同类型的免疫细胞中。顶部SNP rs4823074对全血中该区域的5个基因表现出eQTL效应，MTMR3表现出最强的eQTL作用大小。作者在51名IgAN患者的外周血单核细胞中重复鉴定了rs4823074与MTMR3表达水平（P¼0.001，b¼0.20）的相关性，而其他4个基因没有表现出显著的eQTL。与QTLbase和GTEx的eQTL数据一致，作者证实rs4823074的风险等位基因G与MTMR3的高表达相关。基于IGV浏览器（GTEx Consoritum），作者发现MTMR3的表达受到全血中遗传变异的显著调节，而HORMAD2在该区域没有表现出显著的eQTL（图2b）。值得注意的是，启动子捕获Hi-C数据表明rs4823074和rs16988135均与B淋巴细胞样细胞系中的MTMR3启动子连接（GM12878；图2b）。事实上，MTMR3在B细胞中高度表达，而相邻基因在B细胞中低水平表达。此外，作者在肾小管和肾小球隔室中观察到2个SNPs对MTMR3的显著eQTL效应。肾脏中没有HORMAD2、LIF或OSM的显著eQTL相关性。
接下来，作者评估了来自IgAN患者和健康供体的外周血单核细胞中MTMR3和邻近基因的表达（图2d）。值得注意的是，IgAN患者的MTMR3表达显著高于健康对照组（IgAN与对照组，4.82±0.24 vs.4.58±0.19，P¼1.02×10-5），而HORMAD2、LIF或OSM没有观察到显著差异。
图2
3.MTMR3表达、血清IgA水平和IgAN风险之间的潜在因果关系
为了确定遗传关联和随后的生物学见解，作者针对GWAS目录中列出的所有GWAS的OSM区域交叉注释了MTMR3/HOMAD2/LIF中的所有SNP。至少有58个GWAS已确定与76种人类疾病相关的SNPs特征，包括IgA水平、淋巴细胞计数、炎症肠病和扁桃体切除术（图3a）全基因组显著。
值得注意的是，该基因座的IgAN风险等位基因与较高的血清IgA水平相关，表明这两个性状具有潜在的共同遗传机制。为了评估该地区血清IgA水平和IgAN风险之间的共同遗传病因，作者进行了共定位和孟德尔随机化分析。首先，作者探讨了作者IgAN队列中MTMR3/HOMAD2/LIF/OSM区域与血清IgA水平之间的关系。最高信号为rs4823077（b¼0.12，P¼7.52 10–5），这是一种具有rs4823074（D0¼0.98，r2¼0.92）的强LD变体。作者还证实了先前报道的IgA水平GWAS中的信号（rs1071888；b¼0.13，P¼4.04 10–3）。然后，共定位分析显示，与血清IgA水平相关的变体与该位点的IgAN风险等位基因共定位的概率为88.7%（图3c）。最后，作者使用孟德尔随机化分析来检验这两个性状之间假定的因果关系。结果表明血清IgA水平有因果关系基因座的疾病风险（反向方差加权OR¼4.20/SD暴露，95%置信区间：2.43-7.26，P¼2.60 10-7；图3d）。这些观察结果提出了这样一种假设，即MTMR3/HORMAD2/LIF/OSM区域可能通过增加MTMR3的表达来影响血清IgA水平，而这反过来可能与IgAN风险有因果关系。
图3
4.MTMR3在体外增加IgA1的产生，这取决于其PtdIns3P结合特性
为了证实MTMR3对IgA1产生的影响，作者在分泌IgA1的人B淋巴细胞系（DAKIKI）中进行过表达研究。MTMR3是肌微管蛋白家族的成员，在磷酸酶结构域上与该家族具有同源性，但此外，它包含N末端PH-G结构域和C末端FYVE结构域。在功能上，该蛋白通过PH-G结构域与磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns3P）结合，并用磷酸酶结构域将其脱磷。然而，FYVE结构域不影响MTMR3的酶活性。为了确定MTMR3的结构要求，作者产生了2个MTMR3突变体，其具有PH-G结构域缺失（氨基酸1-119的缺失）和丙氨酸取代的Asp664。
Asp664被预测为胱天蛋白酶1切割位点，位于磷酸酶结构域和FYVE结构域之间。正如预期的那样，作者观察到野生型MTMR3的过表达可以显著增加IgA1的产生。相反，这种作用在过表达PH-G缺失和D664A MTMR3突变体的DAKIKI细胞中受损（图4a）。这些结果证实MTMR3对IgA1产生的影响取决于其PtdIns3P结合特性和假定的胱天蛋白酶-1切割位点。
5.体外B细胞靶向研究揭示了MTMR3在TLR9诱导IgA免疫和自噬降解受损
接下来，作者对MTMR3参与IgA1产生的机制提出了质疑。MTMR3通过PtdIns3P和自噬水平的降低参与Toll样受体的激活。值得注意的是，TLR9的激活以一种不依赖于T细胞的方式增强了B细胞中IgA的产生。与这些结果一致，作者证明了TLR9对DAKIKI细胞中IgA1产生的影响。CpG-ODNs是一种合成寡核苷酸，含有细菌DNA中普遍存在的特异性非甲基化CpG基序，可诱导B细胞活化和特异性依赖TLR9的Ig分泌。作者观察到，CpG-ODN刺激TLR9后，IgA1分泌显著增加(Figure 4b）。此外，用CpG-ODN处理的DAKIKI细胞也显示出以剂量依赖性方式增加的MTMR3表达（图4b）。同时，作者观察到LC3B-II和p62的表达增加，表明自噬降解受损。这些数据表明，MTMR3在IgA1产生中的作用可能是由其在TLR9通路激活中的功能介导的。
图4
6.体内CRISPR-Cas9研究证实MTMR3在B细胞发育和IgA产生中的作用
为了进一步确定MTMR3在TLR9诱导的产生IgA，利用CRISPR技术获得Mtmr3-/-小鼠。10周龄Mtmr3敲除（KO）和野生型小鼠注射磷酸盐缓冲盐水、CpG ODN，或CpG对照（包含GpC而非CpG基序，缺乏刺激性活动，可作为阴性对照）每周3次，持续12周。作者证实，当注射磷酸盐缓冲盐水时，与野生型小鼠相比，Mtmr3 KO小鼠的血清IgA水平显著较低（图5a）。为了确定Mtmr3缺乏是否影响B细胞发育，作者通过流式细胞术分析了小鼠外周血中B细胞的组成，发现与野生型小鼠相比，Mtmr3-KO小鼠的2型（T2）过渡B细胞增加。作者还检测了TLR9激活对IgA和其他抗体产生的影响。在野生型小鼠中，CpG-ODN组的IgA、IgG和IgA-IgG复合物的血清水平显著高于CpG对照组（图5a、b和d）。更重要的是，在Mtmr3 KO小鼠中，作者没有观察到用CpG-ODN刺激TLR9后IgA、IgG和IgA-IgG复合物的血清水平增加。这些观察结果表明TLR9诱导的抗体产生可以被MTMR3的缺乏所抑制。此外，TLR9的激活导致野生型小鼠的肾小球IgA沉积和系膜高细胞性，并且这些病理特征在Mtmr3 KO小鼠中显著减少（图5e和f）。总体而言，作者的数据提供了强有力的支持，表明MTMR3在TLR9诱导的IgA免疫中发挥作用。
图5
接下来，作者对野生型和Mtmr3 KO小鼠的全脾裂解物进行了RNA测序分析与没有CpG ODN相比。这种无偏见的分析确定了许多基因在小鼠组之间差异表达。在TLR9刺激后，与野生型小鼠相比，作者在Mtmr3 KO小鼠中观察到226个具有显著差异表达的基因（图6a）。这些基因在IgA产生的肠道免疫网络、吞噬体的细胞过程和PI3K–Akt信号通路中显著富集（图6b和c），所有这些基因在Mtmr3 KO小鼠中主要下调。自噬途径没有富集，因为大多数自噬相关基因没有实现1.5倍数变化。值得注意的是，TLR9的激活导致自噬相关基因的显著差异表达，而Mtmr3影响Atg5、Atg7和Atg16l1的表达，并促进哺乳动物雷帕霉素复合物1靶点的活性。
RNA测序数据还证实，TLR9诱导Mtmr3（P¼1.75×10–13，log2FC¼0.58）、Map1lc3b（LC3B，P¼4.66×10–7，log2FC¼0.34）和Sqstm1（p62，P¼1.22×10–7，log2FC¼0.24），这与作者在DAKIKI细胞中的发现一致。
图6
总结
在本研究中，作者基于包含 2762 个 IgAN 病例和 5803 个对照个体的 GWAS 数据集进行了精细定位分析，并将 rs4823074 确定为与 B 类淋巴母细胞中的 MTMR3 启动子相交的候选因果变异。孟德尔随机化研究表明，风险等位基因可能通过增加 MTMR3 表达来影响血清 IgA 水平，从而调节疾病易感性。一致地，在 IgAN 患者的外周血单核细胞中观察到 MTMR3 表达升高。进一步的体外机制研究表明，MTMR3 依赖于其磷脂酰肌醇 3-磷酸结合域来增加 IgA 的产生。此外，体内功能证据表明 Mtmr3-/- 小鼠表现出有缺陷的 Toll 样受体 9 诱导的 IgA 产生、肾小球 IgA 沉积以及系膜细胞增殖。RNA-seq 和通路分析表明，MTMR3 缺陷导致 IgA 产生的肠道免疫网络受损。
总之，本研究将MTMR3列为IgAN GWAS使用整合基因组方法的靶基因，以及细胞和动物模型。研究工作表明，MTMR3通过增强TLR9诱导的IgA免疫在IgAN发病机制中发挥作用，并为利用遗传数据探索IgAN的新干预靶点提供了新的见解。
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