英文原题：Direct Modulators of K-Ras-Membrane Interactions
供稿人：周伟杰 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology的文章“Direct modulators of K-Ras-Membrane Interactions”，这篇文章来自于加州大学细胞与分子药理学系和霍华德休斯顿医学研究所的Kevan M. Shokat教授课题组，在这篇文章中，作者通过在K-Ras(G12C)的共价结合剂MRTX849上连接中链脂肪酸，实现对K-Ras(G12C)与细胞膜的蛋白-膜相互作用的直接调节，中链脂肪酸与细胞膜的相互作用帮助改变K-Ras(G12C)相对膜的取向和构象，同时由于锚定作用限制了K-Ras(G12C)的横向迁移并破坏了纳米团簇的形成。
图1. 脂质偶联MRTX849类似物直接调节K-Ras与细胞膜相互作用
以靶向生物界面为目标的双功能分子介导的治疗手段正经历着快速扩展，迄今为止大多数这些策略都集中在调节蛋白质-蛋白质相互作用上，而针对蛋白质-细胞膜相互作用的方法相对未被充分探索。癌症信号传导中的许多靶点例如Ras、P13K、PKC、AKT等会经历瞬时和动态募集到质膜的内层，这些过程可能容易受到相对微妙的药物干预。以K-Ras为例，它的高变区域含有一串赖氨酸残基，这些残基有助于在翻译后戊二烯酰化瞬时与细胞膜结合，抑制戊二烯酰化曾被广泛研究作为抑制K-Ras功能的治疗策略，但最终这种策略由于存在其他预醇化形式而导致K-Ras与细胞膜结合的恢复而失败。最近，基于结合K-Ras(G12C)的Switch II口袋的直接靶向策略开发出了两种已被临床批准的抑制剂sotorasib和adagrasib（图2A），此外这种策略也被应用到其他突变等位基因K-Ras(G12S)、K-Ras(G12R)、K-Ras(G12D)上，这表明了共价结合抑制策略的普适性。
图2. K-Ras-质膜相互作用直接调节剂的设计和合成
在本文中，作者尝试合理设计具有直接调节K-Ras-膜相互作用能力的双功能K-Ras(G12C)抑制剂（图2B），基于已知的K-Ras(G12C)共价结合剂MRTX849与K-Ras(G12C)结合的晶体结构分析所揭示的溶剂暴露位点（图2C），作者设计了一系列具有不同脂质链长度的脂质偶联MRTX849类似物（图2D），在他们的设想中脂质链的添加可以帮助其获得与膜相互作用的能力。
重组K-Ras(G12C)的体外标记表明C5-MRTX和C11-MRTX对K-Ras进行了快速共价修饰，而对照化合物C11’-MRTX和C18-MRTX无法共价标记K-Ras（图3A）。为了测试体外标记结果是否可以顺利转化为K-Ras(G12C)的细胞标记，作者利用脂质链末端的炔基结构进行点击化学反应，将H358(WT/G12C)细胞与相应的MRTX类似物共孵育4小时后进行点击标记、SDS电泳和Western blotting分析，结果显示C5-MRTX和C11-MRTX能够有效与细胞内K-Ras(G12C)发生相互作用，而C18-MRTX没能检测到共价靶向作用（图3B），对此作者提出了一种假设：C18-MRTX所带有的较长脂质尾部具有形成聚集体的倾向，这一假设已被动态光散射实验正式（图3C）。MRTX849与K-Ras(G12C)的Switch II口袋的结合导致其结构折叠得到显著稳定，为了评估脂质体与抑制剂的偶联物是否具有相似的表现，作者使用SYPRO Orange进行了热位移测定，结果表明C5-MRTX、C11-MRTX和MRTX849标记的K-Ras(G12C)相较于未标记的K-Ras(G12C)出现明显的热变形偏移（图3D）。此外作者还对C11-MRTX与非共价对照化合物C11’-MRTX进行了细胞存活率实验，实验结果表明相较于阴性对照组，C11-MRTX的效力显著增强（图3E）。
图3. K-Ras(G12C)抑制剂的生化和细胞生物学性质表征
为了研究C11-MRTX调节K-Ras-膜相互作用的能力，作者采用粗粒化的分子动力学模拟结合Martini 3力场和NMR顺磁弛豫增强（NMR-PRE）对脂质纳米盘上结合的K-Ras(G12C)·MRTX849和K-Ras(G12C)·C11-MRTX进行研究，分子动力学模拟模拟结果表明K-Ras(G12C)·C11-MRTX与膜之间发生短暂的结合会导致K-Ras(G12C)出现异常的双锚定构象（图4A，B）。随后通过直配体-膜接触改率的计算，作者对C11-MRTX相对于MRTX849诱导的膜接触进行了可视化，结果表明C11-MRTX经常与膜发生接触而MRTX849与膜的接触几乎为零（图4C）。NMR结果表明K-Ras(G12C)与C11-MRTX结合时化学位移相比MRTX849发生明显变化（图4D）。
图4. C11-MRTX改变K-Ras(G12C)在膜上构象
随后作者研究了被标记的K-Ras(G12C)在活细胞质膜内层上的横向扩散情况，HeLa细胞中过表达的Halo Tag K-Ras共价连接明亮有机染料，全内反射显微镜测量结果表明C11-MRTX标记的K-Ras(G12C)会导致其沿质膜内层的横向扩散速率显著降低（图5）。
图5. HeLa细胞中K-Ras(G12C)·C11-MRTX的单分子示踪
脂质内膜上K-Ras的空间组织对其生理功能至关重要，瞬态纳米团簇的形成是效应子优先与K-Ras相互作用的关键因素。作者通过电子显微镜结合空间分析测试了C11-MRTX对K-Ras横向组织成纳米团簇的影响，稳定表达GFP-K-Ras的MDCK细胞系中使用C11-MRTX和MRTX849分别处理，固定后用偶联有GFP抗体的4.5nm金纳米颗粒进行标记，通过金纳米颗粒的空间分布来判断纳米团簇的形成能力（图6A-D）。实验结果表明MRTX849和C11-MRTX的处理均降低了金标记密度，这表明它们可以降低K-Ras(G12C)在脂质内膜上的定位，同时C11-MRTX显著降低了GFP-K-Ras(G12C)的Lmax值，这表明K-Ras(G12C)的纳米团簇形成遭到破坏，此外GFP-K-Ras(G12D)纳米团簇形成不会遭到破坏表明了C11-MRTX的选择性（图6E-F）。
图6. K-Ras(G12C)·C11-MRTX在MDCK细胞中的纳米聚集
总的来说，这篇文章报告了一种直接调节K-Ras(G12C)与直至内膜间相互作用的双功能化学方法，通过将C11中链亲脂基团安装在共价K-Ras(G12C)抑制剂MRTX849的溶剂暴露位点，实现膜系留K-Ras(G12C)的新型双锚定构象，从而限制K-Ras的横向移动性并破坏了纳米簇的形成。这一策略可以转化到靶向其他信号传导或脂质结合因子，蛋白-膜相互作用调节剂可以提供有力的工具来剖析这些相互作用的功能，并为新型治疗药物的设计提供思路。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
