真核生物的mRNA通常由5'端前导序列（5' LS或5' UTR），开放阅读框（ORF），和3'端下游非编码区（3' UTR）组成。翻译起始时，携带核糖体小亚基的翻译起始复合物从mRNA的5'帽子结构开始，阅读5'端前导序列，当识别到开放阅读框的起始密码子后，招募核糖体大亚基，起始功能蛋白质的编码【1】。有趣的是，大约64%的人类mRNA和54%的拟南芥mRNA的5'端前导序列内都有上游AUG（upstream AUG或uAUG）【2】，这些uAUG一旦被翻译起始复合物识别并起始翻译，通常会抑制其下游的开放阅读框编码蛋白质【3】。这种抑制对于调控某些蛋白（例如，免疫蛋白，细胞凋亡蛋白）是至关重要的【4-6】，这使得这些蛋白的翻译在正常生长条件下被抑制，而只在某些特定条件下被激活。
那么，是什么机制导致了uAUG在一些条件下被识别，而在另一些条件下不被识别，从而调控下游蛋白翻译呢？
2023年9月6日，美国杜克大学董欣年教授研究团队在 Nature 期刊发表了题为：Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection的研究论文【7】。
该团队结合了高分辨率的翻译组学和结构组学技术，首次揭示了植物免疫过程中，mRNA的结构变化动态调节了翻译起始密码子的选择，由此促进抗病相关的mRNA翻译效率提高，增强了植物的抗病性。
研究团队首先分别对正常生长条件下（mock）和免疫过程中（elf18 treated）的拟南芥进行了高精度的核糖体印记测序。他们发现，在免疫过程中，有1157个mRNA的开放阅读框的翻译水平显著升高。
有趣的是，这些被免疫信号激活的mRNA的5’端前导序列富集了uAUG。在正常生长下，这些uAUG能被翻译起始复合物识别并翻译uORF，导致下游正常的开放阅读框的翻译水平很低，从而有效抑制了免疫基因在植物正常生长时被大量翻译。更有趣的是，在病菌处理一小时之后，这些免疫mRNA的uAUG变得不容易被翻译起始复合物识别，导致其下游的开放阅读框的翻译水平迅速提高，产生大量免疫蛋白，帮助植物抵御病菌侵染。那么，是mRNA的什么特征决定了起始密码子的动态识别？
通过与北卡罗来纳大学教堂山分校的 Kevin Weeks 实验室合作，研究团队开发了In planta SHAPE-MaP技术，可以在体内单碱基分辨率上解析RNA的二级结构。他们发现，在正常生长条件下，这些uAUG的下游具有稳定的RNA发夹结构，这些发夹结构可以有效减缓翻译起始复合物的行进，从而促使其更好地识别uAUG，并从uAUG起始翻译，进而抑制下游正常开放阅读框的翻译。
该团队还与清华大学生命科学学院张强锋实验室合作，基于RNA的序列和结构信息，开发出能准确预测翻译起始位点的深度神经网络模型，揭示了翻译起始位点下游的序列和结构特征，并探究了RNA结构对于翻译起始的重要性。
该研究进而发现，植物在病菌处理后，RNA解旋酶（RH37）的翻译水平迅速升高，这种酶结合在翻译起始复合物中，能有效地解开uAUG下游稳定的发夹结构，导致uAUG不再被识别，从而促进下游免疫蛋白的翻译。由此，他们将这种全新的动态翻译调控元件命名为uAUG-ds（double-stranded RNA structures downstream of uAUGs）。
为了验证uAUG-ds作为一种翻译调控元件的普适性，该团队选取了一个组成性表达基因Tubulin beta-7（TUB7），TUB7 mRNA的5'端前导序列组成单一，没有已知的翻译调控元件，也不被免疫信号激活。该团队发现，当把uAUG-ds放进TUB7 mRNA的5'端前导序列后，该mRNA的正常开放阅读框的翻译水平在植物正常生长时被显著抑制，并且变得能被免疫信号激活。除此之外，该团队在哺乳动物细胞中也发现了uAUG-ds的存在，并验证了其功能。
综上所述，该研究发现了植物免疫过程中，uAUG-ds能动态地调控翻译起始密码子的选择（图1）：在正常生长时，uAUG-ds的存在可以有效减缓翻译起始复合物的行进，从而促使其更好地识别uAUG并翻译uORF，进而抑制下游正常的开放阅读框翻译出免疫蛋白。当病菌侵染时，RNA解旋酶的表达迅速升高，这种酶结合在翻译起始复合物中，能有效地解开uAUG-ds，导致uAUG不再被识别，从而促进下游免疫蛋白的翻译。有趣的是，这种解旋酶在真核生物中的进化极其保守，暗示了这种调控模式的保守性。
该研究开发的翻译起始位点的预测模型也会在未来更好地帮助翻译起始位点的预测和uAUG-ds的设计，从而达到精准地调控蛋白质翻译的目的。
图1：uAUG-ds动态调控起始密码子选择的模式图
值得一提的是，Nature 期刊同期发表了题为：Dynamic regulation of messenger RNA structure controls translation 的评论文章，介绍了这项新工作。
杜克大学生物系的博士毕业生项耶子为论文的第一作者。杜克大学生物系杰出讲座教授、美国霍华德·休斯医学研究所研究员、美国科学院院士董欣年教授为论文的通讯作者。清华大学生命科学学院、结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心的张强锋副教授、黄文泽博士，杜克大学药理学与癌症生物学中心的谭连美博士，杜克大学生物系的陈天元博士、何洋博士，北卡罗来纳大学教堂山分校的Kevin Weeks教授、Patrick S. Irving均参与了此项工作。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06500-y
题图为论文第一作者、董欣年实验室博士生项耶子
参考文献：
1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annu. Rev. Biochem. 83, 779-812 (2014).
2. Zhang, H. Wang, Y., Wu, X., Tang, X., Wu, C. & Lu, J. . Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes. Nat. Commun. 12, 1076 (2021).
3. Calvo, S. E., Pagliarini, D. J. & Mootha, V. K. Upstream open reading frames cause widespread reduction of protein expression and are polymorphic among humans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7507-7512 (2009).
4. Hinnebusch, A. G. Translational regulation ofGCN4 and the general amino acid control of yeast.Annu. Rev. Microbiol. 59, 407-450 (2005).
5. Schulz, J. et al. Loss-of-function uORF mutations in human malignancies.Sci. Rep. 8, 2395 (2018).
6. Vattem, K. M. & Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulatesATF4 mRNA translation in mammalian cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 11269-11274 (2004).
7. Xiang, Y. et al. Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection. Nature In press (2023).
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