NC | 一种新的CRISPR/Cas9 基因编辑系统-II类-B型Cas9核酸酶系统：具有高核酸酶切割活性、低脱靶性能

CRISPR/Cas是一种原核适应性免疫系统，也是用于基因组编辑的强大工具。Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)是CRISPR/Cas系统中最广泛使用的核酸酶之一，它可以通过sgRNA和靶标DNA的碱基互补配对来精确切割基因组。然而，SpCas9在某些情况下可能会导致非特异性切割，产生脱靶效应（off-targets），这严重阻碍了SpCas9在临床上的应用，是CRISPR/Cas系统从基础研究走向临床应用道路上亟待解决的关键问题。研究表明，尽管 sgRNA 间隔区和结合的 DNA序列之间存在多达 5 个碱基的错配，但 SpCas9 核酸酶仍保持切割活性。此外，SpCas9也能引起非预期的诱变活性和可能的基因组重排，这进一步使得SpCas9 的安全性成为日益关注的重点。此外，目前评估编辑结果的方法的灵敏性受到靶向测序深度的影响，也对脱靶检测起到一定影响。

2023年9月6日，Nature Communications 在线发表了题为“A Type II-B Cas9 nuclease with minimized off-targets and reduced chromosomal translocations in vivo”的研究论文。为了克服上述限制，作者开发了一种使用Duplex Sequencing(Duplex-Seq: 利用分子标签对每条 DNA 链添加独立barcode标签，从而能够追踪每条链的序列reads，以区分和纠正测序错误。)的脱靶评估工作流程，这使得针对 Cas9的 脱靶突变的检测有了一个数量级的提升。基于该检测流程，作者发现 SpCas9的 脱靶效应比预期的还要大，这促使我们进一步的寻找具有更高保真度的 Cas9 变体。基于此，作者也鉴定到一种新的Cas9变体 PsCas9 并对其编辑特征进行检测，结果发现与 SpCas9 相比，PsCas9的脱靶编辑和染色体易位均显着减少。

基于Duplex-Seq检测流程，作者设计实验先用之前通过靶向扩增子测序分析过的位点在小鼠体内来评估野生型 SpCas9 的脱靶编辑，结果发现在小鼠肝脏中的脱靶位点上鉴定了野生型 SpCas9 的活性。此外，作者还检测到小鼠基因组中两个 SpCas9 靶位点之间的易位。

随后作者使用生物信息学方法挖掘人类肠道微生物组中以前未注释的 Cas 核酸酶蛋白家族成员，并鉴定了一个 Cas 操纵子，其由 II-B 型特征的基因组结构组成，包含cas4且缺乏csn2。其中cas9基因的蛋白产物与Parasutterella secunda的WP_258333620.1具有高度同源性(99%)，因此作者将其称为PsCas9。通过将PsCas9 与所有已知 Cas 蛋白进行序列比对将其归为II-B 型家族。最后，作者通过将tracrRNA与含有特定间隔序列的crispr RNA（crRNA）融合来设计PsCas9 sgRNA。随后对PsCas9的编辑活性和脱靶特征等进行检测，结果表现出在体内检测中较少的全基因组脱靶切割活性和诱导较少的易位事件发生。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-41240-7

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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