miRNA通过调节基因表达，在植物生长发育、逆境响应等过程中发挥重要调控作用；阐明miRNA的产生和功能机制，对于揭示基因表达调控规律、开发改良作物农艺性状的新资源具有重要意义。植物miRNA由Dicer-Like 1（DCL1）、SERRATE（SE）和Hyponastic Leaves 1（HYL1）组成的复合体切割其前体pri-miRNA产生。DCL1、HYL1及SE共定位于细胞核中并形成2-4个直径为0.2-0.8 μm的切割小体（Dicing body）。戚益军研究组之前发现切割小体由SE蛋白通过液-液相分离驱动组装形成。miRNA前体在切割小体中高效加工为成熟的miRNA，成熟的miRNA随后与HYL1结合，从切割小体中释放至小体外进而发挥功能 (Xie et al, 2021)。这些发现阐明了植物miRNA产生的核心工作机制，但对于切割小体的形成及其在miRNA生成中的作用是如何得到调节的，迄今知之甚少。
环孢亲和蛋白（Cyclophilin，CYP）是一类在动植物体内保守存在的蛋白，是免疫抑制药物环孢菌素A（Cyclosporin A，CsA）的受体。许多CYP具有肽基脯氨酰异构酶（peptidyl-prolyl isomerase，PPIase）活性。它们被发现能够调节基因转录和剪接、调节蛋白质功能并参与信号转导。在拟南芥中，至少有29个CYP。它们位于不同的细胞区室中，调节植物生长和发育、激素信号传导和应激反应。
生命中心戚益军研究组近日发现，定位于细胞核的CYP71利用其PPIase活性促进SE相分离和切割小体形成，增强DCL1-SE-HYL1复合体切割活性，从而促进miRNA加工。该发现揭示了植物切割小体形成及miRNA产生的重要调节机制，以“肽基脯氨酰异构酶CYP71促进拟南芥中SERRATE相分离和miRNA加工（Peptidyl-prolyl isomerase Cyclophilin 71 promotes SERRATE phase separation and miRNA processing in Arabidopsis）为题在《美国国家科学院院刊》（PNAS）在线发表。
在该研究中，戚益军研究组首先通过正向遗传筛选发现，CYP71调控miRNA的产生和植物发育（图1）。CYP71的突变导致很多miRNA的积累水平显著降低，而其靶基因表达升高。在cyp71突变体中，MIR基因的转录水平基本没有变化，但miRNA前体水平升高，提示CYP71可能正向调节miRNA加工。
图1：CYP71突变导致拟南芥发育缺陷和miRNA积累水平降低
研究发现，CYP71可以与SE发生直接相互作用，研究组因此检测了CYP71是否调控SE相分离及切割小体形成。结果表明，在体外，CYP71促进SE相分离及切割小体的组装，在植物体内，CYP71的突变会导致大多数植物细胞不能形成切割小体（图2）。CYP71具有PPIase活性结构域。通过对两个保守的氨基酸残基（R519或F524）进行定点突变，构建了PPIase活性减弱的CYP71变体。发现CYP71变体不能促进SE相分离及切割小体的组装，说明CYP71利用其PPIase活性促进SE相分离及切割小体形成。
图2：CYP71促进SE相分离和切割小体的形成
SE能够通过驱动切割小体的形成提高DCL1-SE-HYL1复合体的切割效率。研究组因此进一步检测了CYP71对miRNA加工的影响。结果表明，CYP71可显著提高体外重组的切割小体的活性，而其PPIase活性减弱变体R519A和F524A则无促进作用。同时，遗传学证据表明，CYP71的PPIase活性为植物体内miRNA的高效生成所必需。
该研究首次揭示了环孢亲和蛋白对miRNA加工的调控功能，并揭示肽基脯氨酰顺反异构化在SE相分离中的重要调控功能。肽基脯氨酰顺反异构化是一种肽键顺式构象与反式构象之间的转变，可通过诱导蛋白质构象变化，改变蛋白质的表面特性，从而调节蛋白质分子之间的相互作用。在小鼠和人类细胞中，能够相分离的蛋白质在肽基脯氨酰异构酶 A（环孢亲和蛋白A）底物中富集 (Maneix et al., 2021)，表明肽基脯氨酰顺反异构化可能是调节蛋白质相分离的通用机制。
戚益军教授为该论文的通讯作者，助理研究员李艳为该论文的共同通讯作者，已毕业博士生赵高展、牛锦荣和2021级博士生海卓妍为共同第一作者，2018级博士生李腾飞，已毕业博士生谢东奇亦参与了工作。该研究由国家自然科学基金委提供经费支持。
参考文献：
Maneix, L., Iakova, P., Moree, S., King, J., Scadden, D., and Catic, A. (2021). Cyclophilin A Regulates Protein Phase Separation and Mitigates Hematopoietic Stem Cell Aging. Exp Hematol 100, S41.
Xie, D., Chen, M., Niu, J., Wang, L., Li, Y., Fang, X., Li, P., and Qi, Y. (2021). Phase separation of SERRATE drives dicing body assembly and promotes miRNA processing in Arabidopsis. Nat Cell Biol 23, 32-39.
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