Title：Cordyceps militaris polysaccharide alleviates diabetic symptoms by regulating gut microbiota against TLR4/NF-κB pathway .
文献来源：International Journal of Biological Macromolecules
IF：8.2
研究背景
2型糖尿病(T2DM)是一种以高血糖、胰岛素抵抗和低度炎症为特征的慢性代谢性疾病，可导致脑血管疾病、糖尿病肾病等严重并发症。T2DM被认为是由饮食不当或不健康、缺乏运动、吸烟和肥胖引起的。随着经济的发展和人们生活质量的提高，T2DM的发病率在世界范围内逐渐增加。根据国际糖尿病联合会2021年发布的数据，全球2型糖尿病患者已达5.37亿人，预计到2030年将增至6.43亿人。因此，加强T2DM研究体系建设，促进T2DM防控机制的建立，已成为科学研究的重要目标。
大量证据表明，肠道菌群失调与糖尿病的发生发展密切相关。肠道菌群的结构变化可引起细菌动态失衡，增加革兰氏阴性菌的丰度，从而产生内毒素。此外，高水平的内毒素可与toll样受体4 (TLR4)结合，激活核因子κb (NF-κB)通路，释放破坏肠道屏障完整性的细胞因子，导致细菌内毒素渗漏到门静脉循环，引发全身慢性炎症反应，从而导致胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常。同时，肠屏障的不完整可启动肠粘膜内的致糖尿病胰岛反应性T细胞，促进自身免疫性糖尿病的发生。
粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)是指将健康供体粪便滤液植入受体肠道，重建肠道菌群，治疗肠道菌群失衡疾病。许多证据表明，FMT在治疗T2DM中起着重要作用，因为FMT可以恢复健康的肠道屏障，从而延缓糖尿病的发展。同时，也有报道表明，FMT可以改善肠道菌群组成，保护肠道屏障。这些结果表明，FMT在修复肠道微生物群紊乱引起的肠道屏障损伤中起着重要作用。
食用菌因其丰富的营养和药用价值，越来越受到研究者的重视。蛹虫草在东亚国家作为传统药物和功能食品被广泛使用了几个世纪。其中蛹虫草多糖的含量最为丰富，有报道称蛹虫草多糖具有多种生物活性，如降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、降糖和抗炎等。我们之前的研究表明，蛹虫草的酸提取多糖(AEPS)可以改善HFD和stz诱导的T2DM的症状。然而，对其抗糖尿病作用的机制尚未深入研究。已有研究证实，蛹虫草多糖在上消化道不被降解吸收，不易消化的多糖可能被肠道菌群分解而发挥作用。
研究方法
动物实验：适应性喂养后，将小鼠分为两组。正常对照组( (NC，n = 10)饲喂普通饲料，糖尿病组(n = 10)饲喂60%高脂饲料。饲粮由酪蛋白(195 g/kg)、麦芽糖糊精(225 g/kg)、蔗糖(89 g/kg)、大豆油(33 g/kg)、猪油(301 g/kg)、纤维素(69 g/kg)、矿物混合物(68 g/kg)、维生素混合物(14 g/kg)、l -胱氨酸(3 g/kg)、双酒石酸胆碱(3 g/kg)和四丁基蒽醌(0.067 g/kg)组成。
饮食干预6周后，所有小鼠禁食不禁水12h。糖尿病组在72h内腹腔注射60 mg/kg柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L, pH 4.5) STZ溶液2次，NC组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。观察2周后，用血糖仪测定各组小鼠的空腹血糖(FBG)，FBG水平≥11.1 mmol/L的小鼠作为T2DM小鼠。然后，将所有T2DM小鼠随机分为两组，模型对照组(MC，n = 10)和AEPSa治疗组(n = 10)。AEPSa治疗组小鼠给予AEPSa 400 mg/kg/ d, NC组和MC组小鼠给予相同体积的PBS，每天灌胃1次，持续6周。试验期间，每周记录摄水量和摄食量，在8、9、11、13、14周分别测定5次空腹血糖。在治疗的最后一周，收集所有小鼠的粪便。整个实验持续14周。实验结束时，在戊巴比妥钠麻醉下处死小鼠。从眼眶采血，迅速切除结肠、肝脏、肾脏和胰腺。收集的样品用于进一步测试。
血清相关指标分析：取血清(2000 rpm, 10 min)，按照试剂盒说明检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、空腹血清胰岛素(FINS)、脂联素(ADP)、瘦素(LEP)、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)和脂多糖(LPS)。胰岛素抵抗的稳态模型评估(HOMA- IR)按下式计算:
口服葡萄糖耐量试验(OGGT)：AEPSa 治疗6周后，进行OGTT。小鼠以2 g/kg葡萄糖溶液灌胃，并在0、30、60、90和120 min时测定血糖水平。
结肠炎性细胞因子分析：采用ELISA试剂盒检测结肠肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6。
紧密连接蛋白与TLR4/NF-κB通路的测定：western blotting检测紧密连接蛋白和TLR4/NF-κB通路的变化。
组织病理学分析：固定结肠、肝、肾、胰腺5μm切片，修整、洗涤、脱水、清理、切片，脱蜡成水，苏木精和伊红染色，中性树脂贴装。最后，在显微镜下观察染色切片并拍照。
16S rDNA测序：采用TIANamp粪便DNA试剂盒提取粪便细菌DNA。采用NanoDrop 2000检测DNA的纯度和浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。采用338F(5′-actcctacgggaggcagag-3′)和806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物扩增16S rRNA基因V3-V4区。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统定量，Illumina MiSeq PE300系统测序。
FMT对T2DM小鼠症状及肠道屏障的影响：FMT实验验证了肠道菌群与AEPSa 介导的调节之间的因果关系。NC组和AEPSa组小鼠在13周和14周收集粪便，保存于-80℃冰箱中，在无菌条件下低温溶解于无菌生理盐水(100 mg/1 mL)中，离心(1000 rpm, 1 min, 4℃)，得到粪便微生物富集液。
研究结果
1、AEPS的纯化及AEPSa的初步表征：
AEPS的纯化：收集一种中性多糖(AEPSa)，用DEAE-52色谱法用去离子水洗脱(图1A)。采用Sephadex G-100层析对AEPSa进行纯化，得到精制AEPSa。纯度测试表明，洗脱曲线为单峰对称峰(图1B)，说明AEPSa为均相化合物。
同质性和MW检验：根据HPGPC曲线(图1C)，在保留时间为14.874 min时出现了一个对称的宽峰，说明AEPSa为均相化合物，与纯化结果一致，其Mw为87.8 kDa。
FT-IR 测试：如图1D所示，-OH拉伸振动在3422.27 cm−1处有较强的吸收峰，C-H拉伸振动有较弱的吸收峰，C-O拉伸振动和C-H弯曲振动分别在1648.6 cm−1和1416.29 cm−1处有较强的吸收峰。在1200cm−1 ~ 1000cm−1范围内，1023.77 cm−1处的峰值为pyranose环的C-O-C伸缩振动。此外，在873.11 cm−1和760.82 cm−1处发现诊断吸收峰，证明AEPSa是具有α-和β-糖苷键的多糖。
单糖组成：HPLC图谱如图1E和F所示，与标准单糖的保留时间相比，AEPSa由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，摩尔比为2.2:15.1:1。
2、AEPSa调节HFD/ stz诱导的T2DM小鼠的饮水、食物摄入、葡萄糖代谢和激素：
与NC组相比，随着实验的进行，MC组的FBG水平不断升高(P < 0.05)。然而，与MC组相比，添加AEPSa明显降低了13周和14周时的FBG水平(P<0.05)。为了进一步了解胰岛β细胞功能和机体对血糖的调节，进行了OGTT(图2C和D)。使用GraphPad Prism 9软件计算OGTT的AUC。与MC组比较，AEPSa干预后，AEPSa组小鼠AUC值显著降低(P<0.05)。此外，AEPSa组小鼠的FINS水平和HOMA-IR明显低于MC组(P<0.05，图2E和F)。此外，与MC组相比，AEPSa显著降低血清LEP水平，升高血清GLP-1和ADP水平(P<0.05，图2G-H)。提示AEPSa对T2DM小鼠的糖代谢和激素有调节作用。
AEPSa调节T2DM小鼠的糖代谢和激素
3、AEPSa降低HFD/ stz诱导的T2DM小鼠的血脂：
如图3A、B所示，MC组小鼠血清TC含量从1.91±0.11 mmol/L显著升高至8.53±0.30 mmol/L，较NC组提高了347.60% (P < 0.05); MC组小鼠血清TG含量从1.09±0.04 mmol/L显著升高至2.80±0.26 mmol/L，较NC组提高了156.88% (P<0.05)。AEPSa干预6周后，TC(4.74±0.59 mmol/L)和TG(1.71±0.13 mmol/L)含量分别显著降低44.43%和38.93% (P < 0.05)。提示AEPSa对T2DM小鼠脂质代谢具有调节作用。
4、AEPSa对HFD/stz诱导的T2DM小鼠肝、肾、胰腺损伤有改善作用：
如图3C、D所示，与NC组相比，MC组AST、ALT活性显著升高(P < 0.05)，说明长期给药HDF/STZ引起肝损伤，而AST、ALT异常变化明显改善(P < 0.05)。同时，肝脏组织病理学图像如图3G所示。NC组小鼠肝脏切片显示肝脏结构正常，肝细胞排列规则，而MC组表现为核萎缩，细胞边界模糊，肝细胞大量坏死，肝细胞肿胀，分散的水泡性脂肪变性和空泡变性。然而，口服AEPSa可明显改善这些异常变化。结果表明，AEPSa可减轻HDF/STZ所致肝损伤。
如图3E和F所示，与NC组相比，MC组BUN和Cr水平显著升高(P < 0.05)，说明T2DM小鼠肾功能受损，而补充AEPSa可显著抑制BUN和Cr的升高。同时，肾脏组织病理学图如图3H所示。NC组小鼠肾切片显示肾小球及周围结构正常，而MC组肾损伤表现为肾小球肿胀、肾小球囊间隙变宽、肾小球边界不明。然而，AEPSa干预明显改善了这些异常变化。
这些结果验证了AEPSa对HDF/ stz所致的肾损伤具有一定的缓解作用。
胰腺的组织病理学图像如图3I所示。NC组胰岛结构正常，呈卵形细胞团，边界清晰，胰腺内各细胞排列规则，细胞核清晰。反之，严重的胰岛损伤表现为胰岛结构异常，边界不清，萎缩。经AEPSa干预后，病理改变均有不同程度缓解。
5、AEPSa对HFD/stz诱导的T2DM小鼠结肠肠道屏障具有保护作用：
F图4A-D显示，与NC组相比，MC组Claudin1、Occludin和ZO-1的表达水平显著下调(P < 0.05)，仅为NC组的56.47%、59.36%和66.03%，说明T2DM小鼠肠道屏障受到损伤。然而，AEPSa明显上调了Claudin1、Occludin和ZO-1的表达，表明AEPSa在一定程度上恢复了T2DM小鼠的肠道屏障。结肠的组织病理学图像如图4E所示。NC组小鼠结肠切片显示结肠上皮完整，隐窝结构排列有序，杯状细胞分布均匀，而MC组结肠损伤表现为明显的炎症浸润，杯状细胞减少，隐窝紊乱，隐窝分支萎缩。经AEPSa干预后，上述病理改变均有不同程度缓解。
黑色箭头代表炎症浸润，红色箭头代表杯状细胞，圆圈部分代表隐窝，黑色宽箭头代表萎缩的隐窝
6、AEPSa抑制HFD/stz诱导的T2DM小鼠血清LPS和结肠TLR4/NF-κB通路：
如图5所示，与NC组相比，MC组血清LPS和结肠TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高(P<0.05)。但AEPSa组血清LPS和结肠TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于MC组。
与NC组比较，MC组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4蛋白表达水平及NF-κBp65、i -κBα磷酸化水平均显著升高(P<0.05)，说明TLR4/NF- κB通路被激活，T2DM小鼠结肠组织发生炎症反应，与结肠组织病理变化相似。然而，AEPSa干预后，TNF-α、IL-1β、IL-6和TLR4蛋白表达的变化以及NF-κB p65和i-κB α的磷酸化被明显逆转。上述结果提示AEPSa可抑制TLR4/NF-κB通路，缓解结肠炎症的发展，结肠组织病理学观察证实了这一结论。
AEPSa抑制T2DM小鼠血清LPS和结肠TLR4/NF-κB通路
7、AEPSa重塑了HFD/STZ诱导的T2DM小鼠肠道微生物群的结构
α和β多样性分析：如图6A、B所示，与NC组相比，MC组的Sobs、ACE、Chao1、Shannon指数显著降低(P < 0.05)， Simpson指数明显升高(P < 0.05)。但与MC组相比，AEPSa干预可显著提高Sobs、ACE、Chao1和Shannon指数，降低Simpson指数(P < 0.05)，说明AEPSa可增加T2DM小鼠肠道菌群多样性和物种多样性。三组间的复盖指数均>0.999，表明所有样品的细菌复盖率均> 99.9%。
主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)显示，NC组和MC组肠道菌群组成的聚类结果明显不同(图6C和D)。添加AEPSa后，MC组和AEPSa组肠道菌群组成的聚类结果明显分离(图S6)。OTU层次聚类树的结果与PCA和PCoA相似。β多样性分析表明，AEPSa可调节T2DM小鼠肠道菌群。
HFD/ stz诱导T2DM小鼠肠道菌群组成及门水平差异：维恩图显示，实验组共发现279个OTU，占71.54%。AEPSa组的OTU数(354)高于MC组(322)，与NC组相同，NC、MC和AEPSa组分别有19个、4个和6个独特的OTU(图6E)。
门水平相对丰度的Circos图显示厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、Verrucomicrobiota、变形菌门(Proteobacteria)、Desulfobacterota、弯曲杆菌（Campilobacterota）弯曲杆菌和放线菌门(Actinobacteriota)占主导地位(图6F）。门水平的热图聚类分析显示，NC组与MC组的聚类结果有显著差异，而AEPSa干预后，AEPSa组的聚类结果与NC组相似，但比例不同(图6G)。各组厚壁菌门和拟杆菌门占总门的比例均大于50%。MC组的厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比(5.44)高于NC组(2.61)，而AEPSa组的F/B比(1.52)下降。
在门水平上，评估了多组之间的差异(图6H-J)。拟杆菌门, 弯曲杆菌和脱铁杆菌群之间的差异最为显著NC、MC和AEPSa组(P<0.05)。与NC组相比拟杆菌、弯曲杆菌和大肠杆菌的相对丰度细菌显著减少(P<0.05)。然而，AEPSa支持的相对丰度明显增加拟杆菌门和弯曲菌门(P<0.05)。这些结果表明在门水平上，肠道菌群明显改善到不同程度的AEPSa补充。
门水平上肠道菌群α和β多样性分析及组成分析
HFD/ stz诱导T2DM小鼠肠道菌群组成及属水平差异：在属水平上的Circos图和相对丰度表显示:未分类的拟杆菌门S24-7菌科、乳酸菌、毛螺菌属NK4A136属、unclassified_f_Lachnospiraceae、嗜黏蛋白阿克曼菌、短链脂肪酸产生菌、埃希氏杆菌、脱硫弧菌、革兰氏阳性菌、拟杆菌和幽门螺杆菌占优势。属水平的热图聚类分析显示，NC组与MC组的聚类结果有显著差异，而AEPSa干预后，AEPSa组的聚类结果与NC组相似，但比例不同(图7A)。
为了进一步分析属水平上微生物群落的变化，评估了两组瘤胃梭菌之间的差异(图7C和D)。与NC组相比，MC组的未分类的拟杆菌门S24-7菌科、短链脂肪酸产生菌、幽门螺杆菌、毛螺菌属NK4A136组和瘤胃梭菌的相对丰度明显降低(P<0.05)，MC组中 肠球菌、瘤胃球菌组和真/优杆菌属显著升高(P<0.05)。经AEPSa处理后，未分类的拟杆菌门S24-7菌科、毛螺菌属NK4A136属、诺维氏梭菌、另枝菌属、幽门螺杆菌和厚壁菌门毛螺菌的相对丰度升高(P<0.05)， 大肠杆菌志贺菌和肠球菌的相对丰度降低(P< 0.05)。此外，利用LEfSe分析了组间不同的分类群(图7E和F)。MC组在属水平上的瘤胃球菌和肠球菌较NC组明显增加，而在属水平上，AEPSa组的未分类的拟杆菌门S24-7菌科、毛螺菌属NK4A136属和厚壁菌门毛螺菌较MC组显著升高。这些结果共同证实了AEPSa干预可以改善T2DM小鼠肠道菌群共生的损害。
属水平上肠道微生物群的组成和差异
HFD/ stz诱导T2DM小鼠肠道菌群与LPS/TLR4/NF-κB通路的关系：图7G显示了属水平上LPS/ TLR4/NF-κB通路与肠道微生物群的Spearman相关分析热图。肠球菌和瘤胃球菌与TNF-α、p-p65、LPS、IL-6、p-Iκbα、TLR4和IL-1β呈显著正相关，幽门螺杆菌、未分类的拟杆菌门S24-7菌科、短链脂肪酸产生菌、厚壁菌门毛螺菌和颤螺旋菌科与TNF-α、p-p65、LPS、IL-6、p- IκBα、TLR4和IL-1β呈显著负相关。因此，LPS/TLR4/NF-κB通路与肠道微生物群的关键种型之间存在关键相关性。
8、FMT改善HDF/ stz诱导的T2DM小鼠的T2DM症状
为了进一步分析肠道菌群与AEPSa介导的调节之间的因果关系，在HDF/ stz诱导的T2DM小鼠中通过流程图(图8A)进行FMT。
与MC组相比，FMT-NC组和FMT-AEPSa组血清中饮水量、摄食量、FBG水平、OGTT AUC、FINS水平、HOMA-IR、TC含量、TG含量、AST活性、ALT活性、BUN水平、Cr水平和LPS水平均显著降低(P< 0.05，图8B-M)。同时，FMT-NC和FMT-AEPSa组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-6、P-IκBα/IκBα、P-p65/p65、TLR4水平较MC组明显降低，claudin、Occludin、ZO-1蛋白水平较MC组升高(P<0.05，图80 - s)。此外，FMT- nc组和FMT- AEPSa组胰腺和结肠的组织病理学异常变化均不同程度地得到改善。这些结果证明FMT可以改善HDF/stz诱导的T2DM小鼠的血脂和糖代谢、肠道屏障、TLR4/NF-κB通路以及肝、肾、结肠和胰腺的损伤，也进一步表明AEPSa处理的T2DM小鼠供体肠道微生物群在这一过程中发挥了重要作用。
结果讨论
本文研究了AEPSa的降糖能力及其潜在机制。结果表明，AEPSa对T2DM小鼠具有明显的降血糖作用，其机制可能是通过增加短链脂肪酸产生菌、另枝菌属、毛螺旋菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）和未分类的拟杆菌门S24-7菌科（norank_f_Muribaculaceae），降低肠球菌和瘤胃球菌对TLR4/NF-κB通路的保护作用来改善高血糖(图9)。进一步表明AEPSa可能通过调节肠道微生物群而成为治疗2型糖尿病的良好选择。
然而，在AEPSa用于预防和治疗T2DM之前，还需要更多的工作来评估其剂量效应和构效关系。
转自：“如沐风科研”微信公众号
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