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导读
獐牙菜(Swertia bimaculata, SB)是一种具有一系列治疗和生物学特性的中草药。本研究旨在探讨SB通过调节肠道菌群减轻四氯化碳(CCl4)诱导的ICR小鼠肝损伤的作用。在B、C、D、E组小鼠中，每隔4天腹腔注射CCl4，共47天。另外，C、D、E组在整个实验期间灌胃SB提取物，每日剂量分别为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。血清生化分析、ELISA、H&E染色和肠道微生物组测序结果显示，SB可显著缓解CCl4诱导的肝损伤和肝细胞变性。SB处理组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平显著低于对照组，而谷胱甘肽过氧化物酶水平显著升高。此外，测序数据表明，添加SB可以通过显著下调Bacteroides、Enterococcus、Eubacterium、Bifidobacterium等致病性肠道细菌的丰度，同时上调Christensenella等有益菌的丰度，恢复CCl4诱导的小鼠肠道微生物变化及其功能。综上所述，本研究发现SB通过调节氧化应激和恢复肠道微生物失调，缓解肝脏炎症和损伤，进而对CCl4诱导的小鼠肝毒性具有有益作用。
论文ID
原名：Swertia bimaculata moderated liver damage in mice by regulating intestine microbiota
译名：獐牙菜通过调节肠道微生物群减轻小鼠肝损伤
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：6.8
发表时间：2023.7
通讯作者：鞠建明，李坤
通讯作者单位：南京中医药大学附属中西医结合医院；南京农业大学动物医学院
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2023.115223
实验设计
结果
1.用SB治疗可减轻CCl4引起的肝脏病变
在本研究的动物实验中，B组实验小鼠的平均日增重明显低于其他ICR小鼠组，特别是CCl4诱导后(图2a)，ICR小鼠肝脏重量明显高于对照组(A)(p < 0.01)，SB处理可降低肝脏重量，尤其高剂量SB(E组；p < 0.05；图2b)处理的实验小鼠。B组CCl4损伤小鼠脏器指数明显高于对照组(p < 0.001)，有趣的是，经SB处理的小鼠肝脏指数在C组(p < 0.05)、D组(p < 0.05)和E组明显降低(p < 0.001；图2c)。
H&E染色分析发现，CCl4通过引起炎症细胞侵袭和肝细胞变性对肝脏造成损害，而SB可以明显降低小鼠的炎症细胞水平和变性肝细胞(图3)。
图1 本研究的实验流程图。A(阴性对照)、B(仅CCl4处理组)，D、E和F分别代表CCl4诱导小鼠肝损伤后SB处理组(50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg)。
图2 (a)獐牙菜对CCl4诱导小鼠体重(n = 12)、(b)肝脏重量(n = 12)、(c)脏器指数(n = 12)的影响。*p < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001。
图3 獐牙菜可改善CCl4对小鼠的肝损伤。黑色箭头：肝细胞变性；绿箭头：炎症细胞。
2.SB对小鼠血清细胞因子水平、抗氧化及生化指标均有影响
添加CCl4显著提高了小鼠血清中ALT(p < 0.0001)和AST(p < 0.001)的含量，而SB处理后，C组(p < 0.01)、D组(p < 0.001)和E组(p < 0.0001) ICR小鼠这两种酶的含量明显降低。B组CCl4诱导的小鼠GSH-px浓度显著低于对照ICR小鼠(p < 0.001)，而添加SB的小鼠GSH-px浓度显著升高(p< 0.001)。B组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平明显降低，而C组(p < 0.05)、D组(p < 0.0001)、E组(p < 0.0001)小鼠在SB处理后血清SOD水平显著升高。CCl4处理后，B组MDA水平明显升高(p< 0.01)，而补充SB后，各处理组(C、D、E组)的MDA含量均明显下降(p < 0.01)。结果还表明，CCl4诱导的小鼠(B组)的IL-1β和TNF-α浓度较高(p < 0.0001)，而补充SB可显著降低小鼠的IL-1β和TNF-α水平。本研究发现各组小鼠的IL-6水平无显著差异(图4)。
图4 獐牙菜对CCl4诱导小鼠血清生化指标、炎症反应及氧化应激的影响。(a) ALT；(b) AST；(c) GSH-px；(d) SOD；(e) MDA；(f) IL-1β；(g) TNF-α；(h) IL-6。*p < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001。
3.用SB治疗可恢复CCl4诱导的小鼠肠道菌群
在本研究中，A组、B组、C组、D组和E组分别产生了81000、69000、78000、84000和82000个原始序列，过滤后所有小鼠组得到超过89%的数据(表1)。不同组小鼠微生物群α多样性无显著差异(图5)。Venn图显示，5组小鼠共享150个ASVs(图6a)。在门水平上，变形菌门为A组(88.94%)、D组(84.39%)和E组(86.69%)小鼠肠道微生物中的主要门，而B组的主要门为变形菌门（44.71%）、厚壁菌门（37.88%）和拟杆菌门（13.88%）。同样，低剂量处理组(C)的主要门为变形菌门(58.44%)和厚壁菌门(32.96%)(图6b)。在纲水平上，Epsilonproteobacteria在A组(85.49%)、D组(81.27%)和E组(84.14%)中占主导地位，而B组的主要菌纲为Epsilonproteobacteria(40.87%)、Clostridia(32.40%)和Bacteroidia(13.84%)，低剂量处理组(C组)中Epsilonproteobacteria(53.55%)和Clostridia(20.79%)是主要菌纲(图6c)。在目水平上，Campylobacterales为A组(85.49%)、D组(81.27%)和E组(84.14%)中的优势目。B组的主要菌目是Campylobacterales(40.87%)、Clostridiales(32.40%)和Bacteroidales(13.84%)，C组中Campylobacterales(53.55%)和Clostridiales(20.79%)是主要菌目(图6d)。在科水平上，A组(85.09%)、C组(53.22%)、D组(80.29%)和E组(83.24%)以Helicobacteraceae为主，CCl4处理组(B组)以螺杆菌科(Helicobacteraceae, 40.37%)和毛螺菌科(Lachnospiraceae, 21.99%)为主(图6e)。在属水平上，A组丰度前3位的属分别为螺杆菌属(Helicobacter, 41.03%)、Flexispira(0.76%)和Blautia(0.50%)，B组为Helicobacter(20.38%)、拟杆菌属(Bacteroides, 10.83%)和Blautia(7.27%)；C组为Helicobacter(31.34%)、乳杆菌属(Lactobacillus, 3.68%)和Turicibacter(1.81%)；D组为Helicobacter(26.82%)、Flexispira(21.39%)和Arcobacter(0.98%)；E组为Helicobacter(41.28%)、Arcobacter (0.90%)和Flexispira(0.53%)(图6f)。
表1 本研究小鼠微生物组的测序数据。
图5 獐牙菜对小鼠微生物组α多样性指标的影响。(a) chao1指数；(b) Faith_pd；(c) Observed_features；(d) Shannon指数；(e) Simpson指数。
图6 獐牙菜对CCl4诱导小鼠不同分类水平肠道微生物组成的影响。(a)维恩图；(b)门；(c)纲；(d)目；(e)科；(f)属。
聚类热图分析显示，在门水平上，A组Proteobacteria、Crenarchaeota、Euryarchaeota、Chloroflexi、SBR1093和Gemmatimonadetes丰度较高，B组Firmicutes、Actinobacteria和Deferribacteres丰度较高，C组Euryarchaeota、SBR1093、SAR406、Thermotogae和Gemmatimonadetes丰度较高，D组Proteobacteria丰度较高，E组Proteobacteria和Deferribacteres丰度较高(图7a)。在纲水平上，A组Epsilonproteobacteri、Gammaproteobacteria、Acidimicrobiia和Thaumarchaeota丰度较高，B组Clostridia、Coriobacteriia、Betaproteobacteria和Deferribacteres丰度较高，C组Gammaproteobacteria、Erysipelotrichi、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Acidimicrobiia和Thaumarchaeota丰度较高，D组Epsilonproteobacteria丰度较高，E组Epsilonproteobacteria和Deferribacteres丰度较高(图7b)。在目水平上，A组Campylobacterales、Vibrionales和Acidimicrobiales丰度较高，B组Clostridiales、Coriobacteriales、Burkholderiales、Deferribacterales和Enterobacteriales丰度较高，C组Erysipelotrichales、Oceanospirillales、Turicibacterales、Vibrionales、Actinomycetales和Acidimicrobiales丰度较高，D组Campylobacterales和Rhodobacterales丰度较高，E组Campylobacterales和Deferribacterales丰度较高(图7c)。在科水平上，A组Helicobacteraceae和Vibrionaceae丰度较高，B组Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Coriobacteriaceae、Porphyromonadaceae和Clostridiaceae丰度较高，C组Lactobacillaceae、Erysipelotrichaceae、Turicibacteraceae和Vibrionaceae丰度较高，D组Helicobacteraceae、Rhodobacteraceae、Campylobacteraceae和Alteromonadaceae丰度较高，E组Helicobacteraceae和Campylobacteraceae丰度较高(图7e)；在属水平上，B组Bacteroides、Blautia、Lachnospiraceae_Clostridium、Adlercreutzia、Parabacteroides和Clostridium丰度较高，C组Lactobacillus、Allobaculum和Turicibacter丰度较高，D组Flexispira、Arcobacter、Anaerospora和Glaciecola丰度更高，E组Helicobacter和Arcobacter丰度较高(图7e)。物种进化树分析发现，A组中Thaumarchaeota、Thermoplasmata、SAR202、A712011、SJA_4、Epsilonproteobacteria、Gemm_2和OPB41的丰度较高，B组中Coriobacteriia和Bacteroidia的丰度较高，C组中Thaumarchaeota、Thermoplasmata、TK17、A712011、AB16、Nitrospira、4C0d_2、Gemm_2、Acidimicrobiia、Actinobacteria、BS119、Erysipelotrichi和Flavobacteriia的丰度较高，D组中Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Synergistia的丰度较高，E组中Epsilonproteobacteria、Deferribacteres和OPB41的丰度较高(图8a)。属水平上，A组中Nitrosopumilus、Helicobacter、Halomonas和Vibrio丰度较高，B组中Sutterella、Klebsiella、Adlercreutzia、Eubacterium、Enterococcus、Candidatus_Arthromitus、Clostridium、Dorea、Blautia和Bacteroides丰度较高，C组中Nitrosopumilus、Halomonas、Vibrio、HTCC、Candidatus_Aquiluna、Allobaculum、Turicibacter、Anaerotruncus和Coprococcus丰度较高，D组中Flexispira、Hydrogenophaga、Glaciecola、Anaerospora、Arcobacterwase丰度较高，E组中Helicobacter、Mucispirillum、Butyricicoccus、Arcobacter丰度较高(图8b)。
图7 聚类热图显示獐牙菜对CCl4诱导小鼠肠道微生物组成的影响。(a)门；(b)纲；(c)目；(d)科；(e)属。
图8 物种进化树热图显示獐牙菜对CCl4诱导小鼠肠道菌群组成的影响。(a)门；(b)属。
4.探究CCl4诱导小鼠SB处理后的标志细菌种类
Beta多样性指数分析发现，通过PCA分析，B组样本与其他组样本之间的距离较远(图9a)，尤其是PCoA(图9b)和Qiime2β(图9c)。DESeq2火山图通过比较B组与其他组小鼠体内的细菌种类，发现B组的Bacteroidetes(p < 0.001)和Firmicutes(p < 0.05)丰度显著高于对照组小鼠(A组)，而CCl4诱导的ICR小鼠(B组)中SBR1093(p< 0.01)、Chloroflexi(p< 0.05)和Crenarchaeota(p< 0.05)的丰度显著较低(p < 0.05)。与B组小鼠相比，低剂量SB组(C组)的Bacteroidetes(p < 0.05)和Deferribacteres丰度显著降低(p < 0.05)，D组中Bacteroidetes丰度(p < 0.001)显著较低，高剂量SB组(E组)中Bacteroidetes丰度显著较低(p < 0.0001)。而添加较高剂量SB的动物体内Deferribacteres(p < 0.05)的丰度显著高于CCl4诱导的动物(图10a)。在属水平上，B组与其他组的细菌种类比较显示，对照小鼠体内Bacteroides(p < 0.0001)、Enterococcus(p < 0.0001)、Parabacteroides(p < 0.001)、Blautia(p < 0.001)、Sporosarcina(p< 0.001)、Lachnospiraceae_Clostridium(p< 0.001)、Ruminococcus(p< 0.01)、Dorea (p < 0.01)、Gemella(p < 0.01)、Anaeroplasma (p < 0.01)、Eubacterium(p < 0.05)、Lactobacillus(p < 0.05)、Gemmiger(p < 0.05)、Bifidobacterium(p < 0.05)、Coprococcus(p < 0.05)、Mycoplasma(p < 0.05)、Bilophila(p < 0.05)、Trabulsiella (p < 0.05)、Marivita(p < 0.05)、Odoribacter(p < 0.05)和Ruminococcaceae_Ruminococcus(p < 0.05)丰度显著较低，而Thalassobius (p < 0.001)、Candidatus_Portiera (p < 0.01)、Pseudoalteromona(p < 0.01)、Nitrosopumilus(p < 0.01)、Paracoccus(p < 0.01)和ZD0117(p < 0.05)丰度显著升高。C组和B组小鼠相比，C组中Blautia(p< 0.0001)、Bacteroides(p< 0.0001)、Eubacterium(p< 0.0001)、 Lachnospiraceae_Clostridium(p < 0.0001)、Trabulsiella(p < 0.0001)、Enterococcus (p < 0.0001)、Parabacteroides(p < 0.001)、Bifidobacterium(p < 0.01)、Christensenella(p < 0.01)、Dorea(p < 0.01)、Gemella(p < 0.01)、 Peptostreptococcaceae_Clostridium(p < 0.01)、Mucispirillum(p < 0.01)、Corynebacterium(p < 0.05)和Propionibacterium(p < 0.05)的丰度显著较低，而Thalassobius (p < 0.001)、Candidatus_Portiera(p < 0.01)、Pelagibacter(p< 0.01)、Pseudoalteromonas(p < 0.05)、Nitrosopumilus(p < 0.05)、Paracoccus(p < 0.05)和ZD0117(p < 0.05)的丰度显著较高。比较D组和B组的小鼠发现，D组中Bacteroides(p < 0.0001)、Enterococcus(p < 0.0001)、Parabacteroides(p < 0.001)、Blautia(p < 0.001)、Lachnospiraceae_Clostridium(p < 0.001)、Trabulsiella(p < 0.001)、Sporosarcina(p < 0.01)、Eubacterium(p < 0.01)、Akkermansia (p < 0.01)、Gemella (p < 0.01)、Dorea(p < 0.05)、Lactobacillus(p < 0.05), Corynebacterium(p < 0.05),Rikenella(p < 0.05), Ruminococcaceae_Ruminococcus(p< 0.05)、Mucispirillum(p < 0.05)、Bifidobacterium、(p < 0.05)、Mycoplasma(p < 0.05)、Ruminococcus (p < 0.05)和Anaerotruncus(p < 0.05)的丰度显著较低，而Flexispira(p < 0.01)、Thalassobius(p < 0.05)和Paracoccus(p < 0.05)的丰度较高。比较E组和B组发现，E组中Bacteroides(p < 0.0001)、Parabacteroides (p < 0.0001)、Sporosarcina(p < 0.0001)、Enterococcus(p < 0.0001)、Blautia(p < 0.001)、Lactobacillus(p < 0.001)、Lachnospiraceae_Clostridium (p< 0.001)、Trabulsiella(p< 0.001)、Eubacterium(p< 0.01)、Gemella(p< 0.01)、Ruminococcus(p< 0.01)、Gemmiger(p< 0.01)、Dorea(p< 0.05)、Ruminococcaceae_Ruminococcus(p < 0.05)、Bifidobacterium(p < 0.05)、Sphingomonas(p < 0.05)和Christensenella(p < 0.05)丰度显著较低(图10b)。网络分析发现，小鼠微生物群中Firmicutes、Bacteroidetes、SAR406、SR1、Actinobacteria、SBR1093、Gemmatimonadetes、Cyanobacteria、ZB3之间呈正相关，Proteobacteria和Actinobacteria呈负相关(图11a)。在属水平上，Helicobacter、Flexispira、Lactobacillus、Staphylococcaceae_Staphylococcus、Desulfovibrio和Allobaculum呈正相关，Staphylococcus、Arcobacter和Vibrionaceae_Vibrio呈负相关(图11b)。
图9 獐牙菜对小鼠微生物组β-多样性指标的影响。(a) PCA；(b) PCoA；(c) Qiime2β。
图10 采用DESeq2火山图分析探究CCl4诱导小鼠经SB处理后的标记菌种。
图11 獐牙菜对小鼠微生物组细菌相互作用影响的网络分析。(a)门；(b)属。
5.SB治疗可影响CCl4诱导小鼠的微生物组功能
功能预测结果显示共有214条酶通路。CCl4处理后B组小鼠增加了41条通路，减少了139条通路，而SB干预逆转了部分CCl4诱导的小鼠效应(图12a)。通过比较不同组的MetaCyc通路发现，在27条通路中，B组有16条通路明显下降，有3条通路明显增加。有趣的是，在C、D和E组小鼠中，SB处理可以不同程度地逆转这种作用(图12b)。KO分析表明，B组小鼠的脯氨酸4-羟化酶丰度较低，而SB处理小鼠的脯氨酸4-羟化酶丰度明显较高(图13a)。在KEGG功能分析中，B组小鼠的光合生物固碳、吲哚生物碱生物合成、萜类和类固醇生物合成、甲苯降解和II型聚酮产物生物合成的途径均明显低于对照组(A)，而柠檬烯和蒎烯的降解则较高。然而，经SB处理的小鼠分别表现出更高水平的萜类和类固醇生物合成、II型聚酮产物生物合成、光合生物固碳、吲哚生物碱生物合成、甲苯降解和更低水平的柠檬烯和蒎烯降解途径(图13b)。KEGG L2预测发现，CCl4处理显著降低了细胞群-真核生物、化学结构转化图谱和感觉系统的通路丰度，而补充SB可以将这些通路的丰度恢复到正常水平(图13c)。KEGG L3分析显示，B组小鼠的造血细胞谱系、长期抑制、光转导、血小板活化和血管平滑肌收缩的丰度明显较低，而C、D和A组小鼠的这些途径的丰度更高(图13d)。
图12 用SB处理可影响CCl4诱导小鼠的微生物组功能。(a)酶丰度；(b) MetaCyc通路丰度。
图13 用SB处理可影响CCl4诱导小鼠的微生物组功能。(a) KEGG Orthology；(b) KEGG；(c) KEGG L2；(d) KEGG L3。
讨论
肝病是全球公认的严重神经健康负担，西方国家报告了数百万例死亡病例。在大多数严重的肝脏疾病中，肝损伤是最初的病理反应。许多研究表明，氧化损伤是由活性氧(自由基)的富集引起的，是导致肝损伤的重要原因。从草本植物中提取的天然化合物以其抗氧化功能而广为人知，包括獐牙菜苦苷、小檗碱、铁芒萁等。
本研究进一步探讨了SB通过调节肠道菌群对肝损伤的调节作用。结果表明，添加SB可减轻CCl4引起的肝脏损伤(图3)，同时小鼠体重增加，肝脏重量减少(图2)。血清中相关酶(ALT和AST)的水平是肝毒性导致氧化应激的直接指标，这两种酶水平的降低也表明了SB治疗的效果(图4)，这与氯喹处理小鼠和铁芒萁处理的肝损伤大鼠的结果一致。SOD和GSH-px在抵抗ROS和其他自由基中起重要作用，MDA水平通常被认为是脂质过氧化和氧化应激的标志。各处理组SOD、GSH-px含量升高，MDA含量降低，表明SB可减轻小鼠的氧化损伤，这与獐牙菜苦甙处理大鼠的结果一致。先前的研究报道IL-1β通过诱导肝细胞损伤和死亡参与非酒精性和酒精性脂肪性肝炎。添加SB的小鼠IL-1β和TNF-α水平降低，表明SB可以减轻肝脏炎症反应，前期研究证实了CCl4通过激活小鼠体内NF-κB来提高TNF-α水平。这些结果表明SB可通过减少氧化损伤来减轻CCl4引起的肝损伤。
以往的研究发现肝脏炎症和损伤与微生物群失调有关，这在本研究中也得到了证实。CCl4引起小鼠肠道菌群结构发生变化，这与败血症相关肝损伤和三氯生引起的肝毒性小鼠实验一致。然而，SB干预可以恢复小鼠的微生物群(图6-8)及其功能(图12，13)。检测标记菌种，发现6门38属在实验小鼠组中存在显著差异(图10)。拟杆菌属可引起宿主不同部位的感染，Eubacterium是一种众所周知的条件致病菌，Bifidobacterium是感染中的条件致病菌属，来自梭菌纲的毛螺菌科与人类和动物的多种疾病有关。Trabulsiella是与沙门氏菌具有同源性且功能相近的属，在添加SB的C、D和E组中，Bacteroides、Enterococcus、Eubacterium、Bifidobacterium、Lachnospiraceae_Clostridium和Trabulsiella的丰度明显降低，说明SB可以减少这六种致病菌属，保护肝脏免受CCl4的损害。Parabacteroides和Ruminococcus的丰度较高，分别与癌症和NAFLD相关，而Parabacteroides和Blautia是肥胖相关患者的标志物，Ruminococcace_ruminococcus与非酒精性脂肪性肝病相关，实验组小鼠Parabacteroides、Ruminococcus、Parabacteroides、Blautia和Ruminococcae_Ruminococcus的丰度较低。结果表明，SB可通过减少这些属来减轻小鼠肝损伤。Sporosarcina通常可以从环境、动物和人类中分离出来，Sporosarcina的丰度差异对小鼠肝脏的影响可能很小。先前研究报道食管癌患者中Dorea的丰度更高，胃癌前病变人群中Gemella丰度较高，而这些属在处理小鼠中的丰度较低可能解释了SB对肝损伤的潜在缓解原因。Anaeroplasma的丰度与小鼠自身免疫性脑脊髓炎的严重程度相关，Coprococcus与多囊卵巢综合征相关，Bilophila是脂肪性肝炎的标志属，Odoribacter与NAFLD相关。虽然Anaeroplasma、Coprococcus、Bilophila和Odoribacte的丰度没有明显下降，但在C组、D组和E组小鼠肠道中其丰度均略有下降。乳杆菌通常被认为是益生菌，尽管它在CCl4处理的小鼠中略高，但在D组和E组中丰度明显更高。先前有研究报道Gemmiger与肝细胞癌有关，在SB处理后的小鼠中(特别是E组)发现该属较低，表明SB可以调节该属以减轻肝损伤。先前的研究发现Mycoplasma与牛乳腺炎有关，在SB处理的小鼠中，该属的丰度较低，特别是在D组，这表明SB可以减少该致病属，以保护肝脏免受CCl4的损伤。Marivita、Thalassobius、Pseudoalteromonas、Nitrosopumilus和Paracoccoccus是海洋环境中常见的属，对肝损伤影响较小。先前的一项研究发现，Christensenella在2型糖尿病中发挥了有益作用，并增强了肝脏的抗氧化能力，在SB处理的小鼠中，特别是在C组中，该属的丰度较高，表明SB与Christensenella在肝损伤中的调节有关。Peptostreptococcae_clostridium是导致鸵鸟高死亡率的相关病原体，Mucispirillum与实验动物脂肪肝相关性肝癌相关，Corynebacterium是动物和人类的严重致病菌属，在SB处理的小鼠中，该属的丰度较低，揭示了SB对肝脏保护作用的潜在原因。
综上所述，本研究证明獐牙菜通过调节氧化应激和肠道菌群来减轻小鼠肝损伤，可能揭示了獐牙菜作为肝脏保护候选药物的潜在作用。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651323007273
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