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导读
生态失调导致炎症性肠病(IBD)的持续发展。本文旨在探讨红景天(Rhodiola rosea L.)中提取的红景天苷(Salidroside，Sal)是否能通过调节微生物群来改善葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎。结果显示，灌胃15 mg kg−1Sal可抑制DSS诱导的小鼠结肠炎，结肠长度、组织学分析、疾病活动指数(DAI)评分以及肠道中巨噬细胞的比例和数量都证明了这一点。Sal部分恢复了结肠炎小鼠的肠道微生物群。粪便微生物群移植(FMT)研究旨在验证因果关系。与DSS处理小鼠相比，Sal处理供体小鼠的FM显著减轻了结肠炎小鼠的症状，包括降低DAI评分、减轻组织损伤、提高粘蛋白(粘蛋白-2)和紧密连接(TJ)蛋白(occludin和ZO-1)的表达，减少肠道中M1巨噬细胞。结果发现，Sal和FMT均影响了肠道微生物群的结构和丰度，表现为属水平上Turicibacter、Alistipes、Romboutsia的相对丰度降低，Lactobacillus的相对丰度增加。此外，当抗生素去除肠道微生物群时，Sal的抗炎作用消失，表明Sal以肠道菌群依赖性方式减轻肠道炎症。因此，Sal可能是治疗结肠炎的一种候选功能性食品。
论文ID
原名：Salidroside alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice by modulating the gut microbiota
译名：红景天苷通过调节肠道菌群缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎
期刊：Food & Function
IF：6.1
发表时间：2023.7
通讯作者：曹永国
通讯作者单位：吉林大学动物医学学院
DOI号：10.1039/d3fo01929b
实验设计
结果
1 Sal给药改善了DSS诱导的急性结肠炎
连续5天在饮用水中添加2% DSS建立实验性结肠炎(图1A)。DAI评分是用于评估DSS诱导结肠炎严重程度的指标。与对照组小鼠相比，DSS组小鼠的DAI评分明显升高，结肠明显缩短(图1B–D)。相反，在DSS诱导的小鼠中，补充Sal显著改善了DAI升高和结肠缩短(图1B–D)。组织学结果显示，DSS组小鼠结肠表现为上皮细胞破坏、炎症细胞浸润和隐窝消失(图1E和F)。Sal干预抑制了DSS引起的肠道损伤(图1E和F)。这些结果表明，Sal可以改善DSS诱导的结肠炎。
图1. Sal给药减轻了DSS诱导的小鼠结肠炎。(A)实验设计。小鼠饮用添加2% DSS的水5天，然后在处死前3天饮用蒸馏水。每天灌胃给药15 mg kg−1Sal。(B)测定DAI评分。(C)测定小鼠的结肠长度，(D)代表性结肠图像。(E) H&E染色的代表性图像，比例尺：50 μm。(F) H&E染色的组织学评分。数据为至少三个独立实验(n=6)的平均值±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
2 Sal给药减少了结肠炎小鼠的促炎巨噬细胞
先前的研究表明，结肠巨噬细胞被认为是IBD的主要效应细胞，肠道细菌通过募集致结肠炎单核细胞和巨噬细胞来诱导结肠炎。因此，本研究测定了巨噬细胞在小鼠结肠组织中的比例和数量。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，DSS组中巨噬细胞的比例和数量显著增加，而Sal给药显著减少了UC小鼠结肠组织中的巨噬细胞(图2A–C)。为了进一步确定结肠组织中巨噬细胞的亚型，我们使用IF分析组织切片。结果显示，与对照小鼠相比，结肠炎小鼠结肠中M1巨噬细胞(F4/80+/iNOS+)的数量增加，但Sal处理显著减少了DSS处理小鼠结肠中的M1巨噬细胞(图2D)。这些数据表明，Sal可以恢复肠道炎症期间的免疫平衡。
图2. Sal给药减少了结肠炎小鼠肠道中的促炎巨噬细胞。(A)流式细胞术代表性图像。测定肠道中巨噬细胞的比例(B)和数量(C)。(D)小鼠结肠中F4/80和iNOS的IF分析。比例尺，100 μm (n=4)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
3 Sal给药调节结肠炎小鼠肠道生态失调
肠道微生物群在维持肠道稳态中发挥着重要作用，肠道生态失调是UC的一个关键病理因素。因此我们探索了Sal给药对UC的影响是否与肠道菌群有关。采用16S rRNA测序检测肠道微生物群的变化。Venn图显示，四组粪便样本中共鉴定出1317个OTUs，其中DSS组有65个OTUs与其他组不同(图3A)。与对照组相比，Chao1指数和Shannon指数显示，DSS组肠道微生物群的丰富度和多样性略有增加。然而，DSS组和DSS+Sal组之间的Chao1和Shannon指数没有差异(图3B和C)。然后，进行β-多样性分析，生成PCoA图，以评估微生物群落之间的相似程度。结果显示，对照组和DSS组之间的细菌群落组成明显不同，而补充Sal的菌群更接近对照组(图3D)。相似性分析(ANOSIM)证实，各组之间存在显著差异(图3E和F)。因此，这些结果表明，Sal给药对结肠炎小鼠的调节作用可能与肠道微生物群结构的改善有关。
接下来，作者确定了不同分类水平下肠道微生物群的相对丰度。门水平上排名前10位的微生物群落如图3G所示。在门水平上，与对照组相比，DSS处理导致厚壁菌门、变形菌门和Elusimicrobia增加，而拟杆菌门减少(图4A、B、E和H)。然而，Sal给药显著增加了拟杆菌门的丰度，降低了变形菌门和Elusimicrobia的丰度(图4A、E和H)。
属水平上的前10个微生物群落如图3H所示。在属水平上，与对照组相比，DSS组中Dubosiella、Turicibacter、Lachnospiraceae NK4A136 group、Alistipes、Romboutsia的数量显著增加，乳杆菌(Lactobacillus)的丰度显著降低(图5A、B、D、E、H和I)。然而，在DSS组中，Sal显著增加了Lactobacillus的丰度，降低了Dubosiella、Turicibacter、Alistipes和Romboutsia的丰度(图5A、B、D、H和I)。
此外，利用线性判别分析效应大小(LEfSe)评估了重要分类群的相对丰度。基于线性判别分析(LDA)>3.5，结果显示，对照组中未发现差异丰富类群。DSS组中厚壁菌门、Clostridia和Erysipelotrichales的丰度增加(图3I)。
图3. Sal给药对DSS诱导的结肠炎小鼠肠道微生物群的影响。(A) Venn图显示了四组肠道微生物群中OTUs的重叠。粪便微生物群的Chao1指数(B)和Shannon指数(C)。(D)–(F)基于Bray–Curtis度量的肠道微生物群主坐标分析(PCOA)图。(G)门水平上排名前10的微生物分类群。(H)属水平上排名前10的微生物分类群。(I)基于LDA的分布直方图(LDA>3.5)(n=4-5)。
图4. 四组在门水平上的肠道微生物群分布。(A)–(I)门水平上选择的细菌(n=4-5)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：不显著。
图5. 四组在属水平上的肠道微生物群分布。(A)–(I)属水平上选择的细菌(n=4-5)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：不显著。
4 Sal处理小鼠的粪便微生物群可恢复结肠炎相关的肠道损伤
为了进一步探索肠道微生物群在Sal治疗结肠炎中的作用，将供体小鼠的粪便悬浮液移植到相应的受体小鼠中(图6A)。结果显示，与DSS组相比，DSS+FMT(Sal)组小鼠的DAI评分明显降低(图6B)。同样，FMT(Sal)干预显著改善了DSS处理小鼠的结肠缩短(图6C和D)。组织学结果表明，与DSS组相比，DSS+FMT(Sal)组受体小鼠的上皮细胞破坏、炎症细胞浸润和隐窝消失明显减少(图6E和F)。粘蛋白-2是肠杯状细胞分泌的主要凝胶形成粘蛋白，在肠道稳态中发挥重要作用。免疫组化(IHC)染色和IF结果显示，粘蛋白-2在DSS+FMT(Sal)组小鼠结肠中的表达高于DSS组(图7A–C)。此外，我们还探讨了FMT治疗是否可以缓解结肠炎小鼠肠道通透性的增加。如图8A、C和D所示，与DSS组相比，DSS+FMT(Sal)组中ZO-1和occludin的表达更高。此外，DSS+FMT(Sal)组的血清FITC-葡聚糖浓度低于DSS组(图8B)。这些结果表明，Sal调节的肠道微生物群在一定程度上是对DSS诱导的肠道损伤的保护作用所必需的。
图6. Sal处理的FMT减轻了DSS诱导的小鼠UC的严重程度。(A)研究设计。小鼠饮用添加2% DSS的水5天，然后在处死前3天饮用蒸馏水。DSS+FMT(Sal)组和FMT+(Sal)组小鼠每天灌胃给药Sal组小鼠粪便微生物混悬液200 μl，连续8 d。对照组和DSS组小鼠灌胃给药200μl PBS。(B)测量DAI评分。测定小鼠结肠长度(C)，代表性结肠图像(D)。(E) H&E染色的代表性图像(放大100倍)，(F) H&E染色的组织学评分。数据为至少三个独立实验(n=6)的平均值±SD，**p<0.01，***p<0.001。
图7. Sal处理的FMT可促进结肠炎小鼠粘蛋白-2的表达。(A)结肠粘蛋白-2的阿尔新蓝分析(放大倍数100×)。(B)结肠中粘蛋白-2的IF分析(放大倍数100×)。(C)每个隐窝粘蛋白-2平均荧光强度，数据为至少三个独立实验(n=6)的平均值±SD。**p＜0.01，***p＜0.001。
图8. Sal处理的FMT改善了结肠炎小鼠的肠道通透性。(A)结肠中ZO-1和occludin的IF分析，比例尺：100 μm。(B) FITC-葡聚糖的血清浓度。(C)和(D)每个隐窝ZO-1和occludin平均荧光强度，数据为至少三个独立实验的平均值±SD (n=3-5)。**p＜0.01，***p＜0.001。
5 Sal给药对巨噬细胞亚型的有益作用可通过FMT转移
根据上述研究结果，Sal给药可调节结肠炎小鼠的肠道生态失调，并且Sal对结肠炎小鼠的保护作用部分是由微生物群介导的。此外，据报道，结肠炎通过募集致结肠炎单核细胞和巨噬细胞诱导结肠炎，我们想知道FMT是否也可以在肠道炎症期间对巨噬细胞亚型起作用。流式细胞术结果显示，DSS+FMT(Sal)组结肠中巨噬细胞的比例和数量低于DSS组(图9A–C)。此外，进一步证实了FMT处理(Sal)后结肠炎小鼠体内M1巨噬细胞减少(图9D)。综上所述，这些数据表明，在肠道炎症期间，Sal干预对巨噬细胞的有益作用可以通过FMT转移。
图9. Sal处理的FMT减少了结肠炎小鼠肠道中的促炎巨噬细胞。(A)流式细胞术的代表性图像。测定肠道中巨噬细胞的比例(B)和数量(C)。(D)结肠中F4/80和iNOS的IF分析，比例尺：100 μm。数据为至少三个独立实验(n=3-4)的平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01。
6 Sal处理小鼠的粪便微生物群调节结肠炎小鼠的肠道生态失调
此外，本研究还利用16S rRNA对DSS+FMT(Sal)组和FMT(Sal)组的肠道微生物群进行了测序。Venn图显示，从四组粪便样本中共鉴定出1194个OTUs，DSS+FMT(Sal)组中有55个OTUs与其他组不同。Chao1和Shannon指数显示，与DSS组相比，DSS+FMT(Sal)组的肠道微生物群没有发生变化。PCoA结果显示，DSS+FMT(Sal)组和DSS组之间的细菌群落组成明显不同。因此，这些结果表明，来自Sal处理的结肠炎小鼠的FM的调节作用可能与肠道微生物群结构的改善有关。接下来，我们检查了不同分类水平上肠道微生物群的相对丰度。基于LDA>4的条件，使用LEfSe评估了重要分类群的相对丰度(图S1G，ESI†)。
在门水平上，与DSS组相比，DSS+FMT(Sal)组放线菌门的相对丰度显著增加，而Elusimicrobia的相对丰度降低。在属水平上，与DSS组相比，DSS+FMT(Sal)组具有更高水平的Lactobacillus、Dubosiella和Candidatus saccharimonas，而Turicibacter、Bacteroides、Alistipes和Romboutsia的水平降低。
7 Sal以肠道菌群依赖性方式减轻结肠炎
为了研究肠道微生物群是否参与Sal对DSS诱导的结肠炎的保护作用，将小鼠的肠道微生物群在DSS干预前去除。如图S4A所示，用ABX混合物处理小鼠5天，然后在其饮用水中给予2% DSS 5天，随后再给予正常饮用水3天。值得注意的是，在肠道微生物群耗尽后，ABX+PBS组小鼠和ABX+Sal组小鼠显示出难以区分的DAI评分、结肠长度、组织病理学染色和组织学评分。这些结果表明，Sal对DSS诱导的结肠炎的抗炎保护作用具有肠道微生物群依赖性。
讨论
许多研究报告称，肠道生态失调可导致或加重UC。抗炎或免疫抑制药物在UC治疗中往往无法保持长期效果，这突出了对新的治疗策略的需求。目前，饮食是塑造肠道微生物群的一种简单有效的方法，可用于治疗肠道微生物群相关疾病。因此，本研究探讨了Sal对DSS诱导的小鼠肠道损伤的保护作用，该作用部分是通过调节肠道菌群介导的。
Sal是从红景天中提取的一种酚苷，长期以来一直被用作功能性食品的重要成分。它的抗炎、抗氧化和神经保护作用已被证实对许多疾病有效。最近，Wang等人证明，膳食补充剂红景天提取物抑制DSS诱导的小鼠结肠炎，这与重塑肠道微生物群的作用有关。有趣的是，在提取物中共鉴定出63种化合物，并测定了两种生物活性成分的含量(Sal，1.81%和rosavin，0.034%)。先前的一项研究证明，Sal通过调节肠道微生物群来改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎。此外，Sal通过肠-脑轴减少小鼠海马依赖性记忆损伤。因此，本研究假设Sal补充剂可以作为一种营养干预，通过调节肠道微生物群来改善UC。
DSS诱导的结肠炎小鼠表现出与UC患者相似的症状，其特征是体重减轻、腹泻、结肠缩短、炎症反应、肠道损伤和肠道生态失调。因此，DSS已被广泛用于建立小鼠结肠炎模型。肠上皮细胞的上部有粘液，它可以阻止病原体、饮食抗原和毒素进入肠上皮。在粘蛋白中，粘蛋白-2是胃肠道最具特征的分泌性粘蛋白。粘蛋白-2是肠道粘液的主要成分，存在于小肠和大肠中，并形成粘液骨架。此外，肠上皮细胞通过TJ蛋白(如ZO-1和occludin)紧密偶联，这进一步阻止了病原体的侵袭。因此，粘蛋白和TJ蛋白协同促进肠上皮稳态。一旦肠道屏障被破坏，易位的病原体或毒素(如脂多糖，LPS)将激活免疫细胞，从而进一步促进结肠炎症。本研究的结果表明，Sal给药显著改善了DSS诱导的小鼠结肠炎，表现在DAI评分降低和结肠长度增加。组织病理学结果显示，Sal给药显著改善了隐窝消失，改善了肠壁完整性，并减少了炎症细胞的浸润。此外，本研究的结果表明，Sal给药大大减少了结肠炎小鼠结肠中促炎巨噬细胞的数量。在IBD中，巨噬细胞大量浸润肠粘膜，新募集的巨噬细胞被认为是炎症细胞因子产生的主要贡献者，而炎症细胞因子在IBD的发病机制中起着核心作用。因此，Sal的抗结肠炎作用可能与调节肠道微环境有关，从而防止过度的免疫激活。
肠道微生物群在结肠炎的发展中起着关键作用。肠道生态失调会激活身体的免疫反应并导致肠道损伤。UC的发展与肠道微生物群的紊乱有关，这导致有害细菌的过度增殖和益生菌的减少。本研究表明，Sal干预并未改变结肠炎小鼠肠道微生物群的α多样性(Chao1和Shannon指数)。然而，PCoA结果显示，在前两个成分的基础上，DSS+Sal组与DSS组分离。这些结果表明，Sal给药不会影响结肠炎小鼠肠道微生物群的丰富度和多样性。然而，在Sal给药后，结肠炎小鼠肠道微生物群的组成有所改善。因此，可能是细菌群落组成(而非物种丰富度)驱动了对UC的保护作用。
在分析肠道微生物群多样性的基础上，评估了门和属水平的肠道微生物群组成和相对丰度，以研究Sal对UC小鼠肠道微生物结构的影响。在门水平上，厚壁菌门、变形菌门和Elusimicrobia的相对丰度显著增加，而拟杆菌门的相对丰度显著降低。然而，与DSS组相比，Sal给药降低了结肠炎小鼠中变形菌门和Elusimicrobia的相对丰度，增加了拟杆菌门的相对丰度。Sal干预对结肠炎小鼠厚壁菌门的丰度没有显著影响。先前的一项研究表明，UC患者中变形菌门的丰度增加。高丰度的变形菌是微生物群生态失调的标志。Elusimicrobia是一个相对较新定义的门，与动物相关，依赖于发酵。一些研究报告称，Elusimicrobia与睡眠质量和抑郁有关。本研究表明，Elusimicrobia的丰度可能与UC的严重程度呈正相关。
16S rRNA测序结果表明，Sal给药对结肠炎小鼠的有益作用与肠道微生物群的调节有关。为了探讨Sal给药是否通过调节肠道微生物群来改善DSS诱导的小鼠结肠炎，我们进行了一项FMT试验。将供体小鼠的粪便细菌悬液通过灌胃移植到受体小鼠。Sal干预小鼠的粪便悬浮液对DSS诱导的损伤表现出更好的效果，包括改善DAI评分、结肠长度和组织学损伤。此外，与DSS+FMT(PBS)组相比，DSS+FMT(Sal)组小鼠的粘蛋白-2和TJ蛋白表达增加。流式细胞术和IF结果显示，与DSS+FMT(PBS)组相比，DSS+FMT(Sal)组小鼠肠道中的M1巨噬细胞减少。这些结果表明，Sal给药引起的肠道菌群调节可能有助于改善肠道通透性，减少潜在易位病原体，降低结肠巨噬细胞的激活，从而减轻肠道炎症。
本研究还使用16S rRNA对DSS+FMT(Sal)组和FMT(Sal)组的肠道微生物群进行了测序。结果发现，Sal和FMT都会影响肠道微生物群的结构和丰度。两种处理同时降低了Turicibacter、Alistipes、Romboutsia的丰度，并提高了Lactobacillus的丰度。乳杆菌是一种众所周知的益生菌，已被证明具有抗炎作用，可产生短链脂肪酸(SCFAs)和细胞囊泡。在本研究中，与结肠炎小鼠相比，Sal和FMT处理的结肠炎小鼠的Lactobacillus水平升高。有研究表明，Turicibacter与结直肠癌(CRC)的发展相关，其潜在机制包括促进慢性炎症、DNA损伤和产生生物活性致癌代谢物，这些在结肠炎动物模型和CRC患者中增加。在本研究中，我们发现Sal和FMT处理都减少了DSS诱导结肠炎中的Turicibacter。此外，兼性病原体Alistipes可以利用肠杆菌素作为铁源，在Lipocalin 2−/−IL-10−/−小鼠中繁殖，程度足以诱导结肠炎。用Sal和FMT处理的结肠炎小鼠中，Alistipes的水平也降低。最近的一项研究报告称，不含麸质和淀粉酶-胰蛋白酶抑制剂(ATI)的饮食可能会改善IBD患者的肠道炎症和屏障功能的生物标志物，并伴有肠道微生物群的相关变化，包括病原体Romboutsia ilealis的减少。Liu等人证明2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)和低聚半乳糖(GOS)可减轻DSS诱导的小鼠结肠炎，同时抑制Romboutsia，并富集Akkermansia、Bifidobacterium、Faecalibaculum和unclassified_f_Lachnosipiaceae。在本研究中，与结肠炎小鼠相比，用Sal和FMT处理的结肠炎小鼠Romboutsia水平降低。此外，ABX处理后肠道微生物群耗竭，Sal的抗炎作用消失，表明Sal减轻肠道炎症的方式依赖于肠道菌群。
结论
综上所述，本研究证明，Sal通过调节肠道生态失调显著减轻UC。FMT和肠道微生物群耗竭研究旨在验证因果关系。结果发现，Sal和FMT都会影响肠道微生物群的结构和丰度，表现为属水平上Turicibacter、Alistipes、Romboutsia的相对丰度降低，Lactobacillus的相对丰度增加。因此，本研究的结果表明，Sal有可能成为一种新的候选功能性食品或UC的新治疗策略。
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