导读
肠道微生物群失衡已被证实与肥胖和代谢综合征有着密切的病理和生理相关性。2020年，中国国家药品监督管理局批准从桑枝中提取的桑枝总生物碱（SZ-A）用于治疗2型糖尿病。除了降血糖作用外，先前的研究已经证实，SZ-A还可以缓解高脂肪饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪肝，并改善与肥胖相关的脂肪组织代谢和炎症，表明SZ-A具有调节肥胖和代谢综合征的潜力。然而，尚不清楚SZ-A是否可以通过调节肠道微生物群及其代谢谱来改善肥胖和代谢综合征。本研究旨在评估SZ-A对肥胖小鼠肠道微生物群的影响，并探讨肠道微生物群变化、肥胖和脂质代谢之间的关系。结果表明，口服SZ-A可显著降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠体重、脂肪量以及血清总胆固醇和低密度脂蛋白水平。SZ-A还调节肠道微生物群，并改变肥胖小鼠的粪便代谢产物组成。与高脂饮食组相比，SZ-A组厚壁菌门与拟杆菌门的比例发生了变化，双歧杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度在属水平上显著增加。SZ-A组的肠道微生物群被重塑，胆汁酸代谢和脂肪酸代谢中微生物基因的相对丰度被改变，这与代谢组学结果一致。此外，SZ-A极大地富集了杯状细胞的数量，并减少了肥胖小鼠高脂饮食诱导的炎症性结肠损伤和促炎性巨噬细胞浸润。总之，SZ-A可以通过改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的肠道微生物群及其代谢特征来缓解肥胖和代谢综合征。
桑枝总生物碱（SZ-A）调节高脂饮食诱导肥胖小鼠肠道微生物群紊乱及其代谢谱的示意图
论文ID
原名：Ramulus mori (Sangzhi) alkaloids regulates gut microbiota disorder and its metabolism profiles in obese mice induced by a high-fat diet
译名：桑枝总生物碱可调节高脂饮食所致肥胖小鼠肠道菌群紊乱及其代谢谱
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.6
发表时间：2023.03
通讯作者：蒋伟哲，刘玉玲
通讯作者单位：广西医科大学药学院，中国医学科学院北京协和医学院
实验设计
实验结果
1. SZ-A能有效调节高脂血症所致肥胖小鼠的体重
为了研究SZ-A对肥胖的治疗作用，C57BL/6J小鼠被喂食高脂饮食（HFD）14周，然后SZ-A（200mg/kg/d）每天口服给予小鼠，持续喂食HFD 6周（图1A）。目前的临床降血糖剂量为5 mg/kg，小鼠的降血糖剂量转换为60 mg/kg。为了探索SZ-A在减轻体重方面的潜力，我们之前研究了在HFD喂养的KKAy小鼠中用100和200 mg/kg SZ-A处理8周，在HFD喂食的C57BL/6J小鼠中用400 mg/kg SZ-A处理6周的减肥效果。结果表明，在这个干预时间和剂量下，SZ-A对减肥有很好的效果。根据先前的结果，本研究以HFD喂养的C57BL/6J小鼠为模型，用200mg/kg SZ-A干预6周，以进一步探讨SZ-A的减肥作用及其对肠道微生物群和代谢的调节作用。如图1B所示，喂食HFD的小鼠的体重明显高于喂食正常饮食的小鼠，与HFD组相比，SZ-A显著减缓了HFD诱导的体重增加（图1C）。除了肥胖小鼠的体重外，我们还使用磁共振成像（MRI）测量了全身脂肪质量。如图1D所示，与HFD组相比，给予SZ-A降低了全身脂肪质量。此外，SZ-A处理后，血清总胆固醇和低密度脂蛋白（LDL）水平显著降低（图1E、F）。结果表明，SZ-A有效缓解了HFD诱导的C57BL/6J小鼠肥胖，这与我们之前的研究结果一致。
图1 SZ-A减缓了HFD诱导的肥胖小鼠的体重增加
（A）通过口服SZ-A缓解肥胖小鼠体重增加的流程图。在这个实验中，C57BL/6J小鼠被喂食高脂肪饮食14周，然后每天口服SZ-A（200mg/kg/天），持续6周。（B）喂食正常饮食（NC）或HFD（n=10）的小鼠体重。（C）SZ-A（200 mg/kg）处理小鼠的体重变化（n=9-10）。（D）用SZ-A（200mg/kg）处理的小鼠总脂肪量（n＝5）。（E）SZ-A（200mg/kg）对血清胆固醇水平的影响（n=5）。（F）SZ-A（200mg/kg）对血清低密度脂蛋白水平的影响（n=5）。每个值表示为平均值±SEM。***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05。
2. SZ-A诱导肠道菌群组成的变化
上述结果表明，SZ-A可以有效调节HFD诱导的肥胖小鼠体重。肥胖作为一种慢性代谢性疾病，已被证实与肠道微生物群密切相关，口服药物对肠道微生物群和代谢的影响最为显著。为了研究HFD诱导的肥胖小鼠肠道微生物群的变化，C57BL/6J小鼠首先喂食HFD 14周，并通过灌胃SZ-A的方式接受处理，同时继续喂食HFD。实验结束后，我们收集所有小鼠的粪便，通过Illumina NovaSeq对16S rRNA基因的V3-V4区域进行测序，并分析细菌群落结构。
为了研究每个样本的物种组成，我们进行了具有97%同一性的OTUs（操作分类单元）聚类；接下来，对OTU序列进行物种注释。根据物种注释结果，我们选择每个样本或门水平分组中丰度最高的前10个物种，生成物种相对丰度的柱状累积图，直观地查看不同分类水平下相对丰度高的物种及其在每个样本中的比例（图2A），还对结果进行了微生物多样性分析。alpha多样性反映了样本中微生物群落的丰富度和多样性（图2B）。稀疏度和秩-丰度曲线（反映测序数据量和物种丰富度的合理性曲线）表明，本实验中测序数据量合理，物种分布均匀（图2C、D）。Shannon、Chao1、ACE和观察到的物种指数（一种评估样本中物种丰富度和多样性的指数）显示，喂食HFD的肥胖小鼠在接受SZ-A处理后，肠道微生物群多样性和丰富度显著增加（图2E-H）。除SZ-A外，二甲双胍（Met）还显著增加了肥胖小鼠肠道微生物群的丰富度和多样性，与HFD组相比，Shannon、ACE和观察到的物种指数都有所增加。然而，我们在阿卡波糖（Acb）组中没有观察到显著的变化。
β多样性是对不同样本的微生物群落组成进行比较分析，以确定不同群体之间的差异。主坐标分析（PCoA）结果表明，SZA组存在显著的微生物群落组成簇，表明SZ-A对HFD诱导的肥胖小鼠肠道微生物群有显著影响（图3A）。为了研究肠道微生物群的具体变化，我们进行了UPGMA聚类树分析，以比较各组测序中确定的主要类群的相对丰度。在门的水平上，与正常对照组（NC）相比，HFD组厚壁菌门与拟杆菌门的比例严重失调：厚壁菌的丰度显著增加，而拟杆菌门细菌数量显著减少。SZ-A可以调节这两种细菌的比例，以实现与正常对照组（NC）相似的菌群结构（图3B）。厚壁菌门/拟杆菌门的比例是肠道微生物群动态平衡的标志，厚壁菌门/拟杆菌门比例的降低与体重减轻直接相关。
为了进一步探索每个样本之间的差异，我们进行了Lefse分析（LDA Score=4）。与HFD组相比，SZ-A组的微生物群落表现出显著变化，其特征是疣微菌门和放线菌的水平显著增加（图3C、D）。在属水平上，SZ-A组的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akk）和双歧杆菌比其他组更富集（图3E、F）。Akk已被证明可以促进肠道屏障的完整性，调节免疫反应，抑制炎症，平衡肠道微生物群和其他功能，这使得它在治疗代谢性疾病方面具有巨大的潜力。这些结果表明，SZ-A可以改变HFD诱导的肥胖小鼠的肠道微生物群结构。
图2 SZ-A通过α多样性分析改善了HFD诱导的肥胖小鼠的肠道微生物群多样性和丰富度
（A）物种柱状累积图的相对丰度。（B）SZ-A处理后α多样性指数增加。（C）稀疏曲线。（D）秩丰度曲线。（E–H）计算了四个α多样性指数（Shannon、ACE、Chao1和Observed_species）（n=6）。样本菌群的复杂性可以通过指数值来反映。每个值表示为平均值±SEM。与HFD相比，* p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
3. SZ-A调节HFD诱导的肥胖小鼠的代谢
为了更好地了解SZ-A对肠道微环境的影响，我们使用代谢组学来检测小鼠粪便中代谢物的变化。在实验结束前，我们收集所有小鼠的粪便，并使用LC-MS/MS进行代谢组学研究。为了更好地研究SZ-A对HFD诱导的肥胖小鼠的干预作用，我们使用多变量统计分析来筛选SZ-A干预后小鼠的差异代谢产物。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）的结果表明，无论是正离子模式还是负离子模式，各组样品的分散程度都很小，浓度趋势明显。正常对照组（NC）和HFD组的样本显示出分离的趋势，这表明HFD诱导的肥胖小鼠的代谢产物水平发生了变化。SZ-A处理后，SZ-A组的样本与正常对照组（NC）的样本更相似，表明SZ-A干预可以调节HFD诱导的肥胖小鼠的代谢紊乱（图4A）。此外，质量控制（QC）样品点被聚集，表明分析方法的稳定性和重复性良好，实验结果可靠。
图3 SZ-A通过β-多样性分析改变了HFD诱导的肥胖小鼠的肠道菌群结构
（A）PCoA，主坐标分析。（B）UPGMA，非加权组配对算术平均法。（C）LEfSe，LDA效应大小。（D）LEfSe，分支图。（E）属水平上嗜黏蛋白阿克曼菌的丰度（n=6）。（F）属水平上双歧杆菌的丰度（n=6）。每个值表示为平均值±SEM。与HFD相比，***p＜0.001。
为了进一步揭示SZ-A干预前后HFD诱导的肥胖小鼠体内代谢产物的变化，并筛选差异代谢产物，我们主要参考VIP、FC和p值。VIP是指PLS-DA模型第一个主成分中的变量投影重要性，代表代谢物对分组的贡献。FC指的是倍数变化，这是比较组中每种代谢物的所有生物重复的平均值的比率。阈值设置为VIP>1.0、FC>1.2或FC<0.833，p值<0.05。结果显示，HFD组的代谢物与NC组和SZ-A组的代谢物有显著差异（图4B、C）。在筛选出的差异代谢产物的基础上，我们进一步进行了KEGG富集分析，结果显示，与HFD组相比，差异代谢产物在SZ-A处理后主要富集在代谢途径中（图4D）。其中，SZ-A组和HFD组在氨基酸、不饱和脂肪酸和胆汁酸代谢方面存在显著差异（图4E）。热图结果显示，在HFD诱导的肥胖小鼠中，SZ-A处理后，二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳四烯酸（DHA）、α-亚麻酸和lipocholic acid（LCA）等有益物质在缓解肥胖和代谢紊乱过程中的表达水平显著增加（图4F）。我们在SZ-A干预后进行了肠道微生物群和宿主代谢产物之间的相关性分析。属水平上相对丰度最高的10个细菌群与靶向代谢组学结果相关。如图4G所示，Akk和双歧杆菌与EPA、氨基酸和胆汁酸呈正相关，表明SZ-A干预后，肠道中Akk和双歧杆菌丰度的增加与代谢的改善显著相关。本研究的一个局限性是SZ-A的代谢调节没有与NC组进行比较。这些结果表明，HFD可诱导小鼠肥胖并导致代谢紊乱，SZ-A可有效调节HFD诱导的肥胖小鼠的代谢紊乱。
图4 SZ-A调节HFD诱导的肥胖小鼠的代谢紊乱
（A）PLS-DA，偏最小二乘判别分析。（B，C）火山图。（D）京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路注释。（E）KEGG富集途径。（F）热图。（G）SZ-A干预后肠道微生物群与宿主代谢产物的相关性分析。
4. SZ-A减轻HFD诱导的肥胖小鼠结肠炎症损伤和促炎巨噬细胞浸润
考虑到肥胖患者长期经历慢性低度炎症，肠道屏障的完整性在肥胖的发生和发展中起着至关重要的作用。我们通过苏木精和伊红（H&E）染色评估结肠的组织学变化。如图5所示，HFD模型组黏膜及黏膜下层有炎症细胞浸润，杯状细胞大幅减少，表面上皮受损。SZ-A处理后，粘膜上皮无明显损伤，无明显炎症浸润，杯状细胞丰富。有人认为，长期使用SZ-A治疗可以恢复肥胖引起的肠道屏障完整性。
图5 SZ-A减轻了小鼠结肠炎症损伤和促炎巨噬细胞浸润
结肠切片的代表性H&E染色图像。
讨论
代谢综合征是一种人体内的蛋白质、脂肪、碳水化合物和其他物质代谢紊乱的病理状态，它包括一组复杂的代谢紊乱综合征。肥胖作为一种慢性代谢性疾病，不仅是代谢综合征的主要驱动因素，而且与肠道微生物群密切相关。肠道微生物群失衡已被证实与肥胖和代谢综合征有着密切的病理和生理相关性。近年来，对肠道微生物的研究颠覆了我们对活生物体的传统概念。许多新的研究结果，如肠脑轴、肠肝轴和肠胰轴，已经向我们表明，肠道微生物群是我们身体基因组之外的第二个基因组，与身体本身一起构成所谓的“超级有机体”。与此同时，这些研究还表明，肠道微生物在维持我们的健康方面发挥着至关重要的作用。通过与身体的相互作用，肠道微生物创造了一个独特的身体特异性超生物“环境”，从而在疾病的发生和发展中发挥着非常重要的作用。微生物失衡是包括肥胖在内的许多慢性代谢疾病的触发点。恢复肠道微生物群的动态平衡对于代谢性疾病的治疗至关重要。二甲双胍和阿卡波糖是治疗2型糖尿病和肥胖症最常用的药物。研究发现，二甲双胍可以通过增加嗜黏蛋白阿克曼菌和产生丁酸盐和丙酸盐的微生物组来改善患者的糖脂稳态。阿卡波糖可以增加肠道微生物群中乳酸杆菌和双歧杆菌的相对丰度，并降低拟杆菌的相对丰富度，从而改变参与胆汁酸代谢的微生物基因的相对丰度，并对代谢产生有益影响。因此，调节肠道微生物群并恢复其动态平衡是一种新的有效治疗方法，具有很大的前景。
SZ-A已于2020年被中国国家药品监督管理局批准用于治疗2型糖尿病。除了降血糖作用外，先前的研究已经证实，SZ-A还可以缓解高脂肪饮食诱导的肥胖和非酒精性脂肪肝，并改善与肥胖相关的脂肪组织代谢和炎症，这表明SZ-A有可能调节肥胖和代谢综合征。然而，SZ-A是否可以通过调节肠道微生物群及其代谢谱来改善肥胖和代谢综合征尚不清楚。在本研究中，我们评估了SZ-A对HFD诱导的肥胖小鼠肠道微生物群的影响。我们发现，用SZ-A处理后，肠道微生物群的组成发生了显著变化。例如，在HFD组肥胖小鼠的粪便群落中，具有较强能量利用效率的厚壁菌门相对丰度显著较高，而具有较低营养吸收效率的拟杆菌门的相对丰富度较低。用SZ-A处理后，拟杆菌门与厚壁菌门比例与正常对照组（NC）相似。在属的水平上，我们进一步观察到，与HFD组相比，SZ-A组中嗜黏蛋白阿克曼菌（Akk）和双歧杆菌两个属的丰度显著增加。Akk和双歧杆菌可能参与减少HFD诱导的肥胖小鼠的炎症和肥胖。据报道，在患有肥胖/2型糖尿病的小鼠中，Akk的丰度显著降低。如果可以通过益生元或喂食Akk来增加Akk的丰度，那么HFD引起的代谢问题可以在不改变饮食的情况下得到改善，代谢紊乱甚至可以逆转。同样，研究者们在儿童和成人肥胖患者的临床试验中也证实了Akk的丰度较低。同时，大量研究表明，Akk菌还可以促进GLP-1分泌、胰岛素敏感性和肠道微生态丰富度，在代谢综合征的治疗中发挥重要作用。研究发现，双歧杆菌具有胆汁盐水解酶活性，可以调节胆汁酸池的大小和每种胆汁酸成分的比例，并将初级胆汁酸和结合胆汁酸转化为次级胆汁酸，如脱氧胆酸和石胆酸。G蛋白偶联受体5（TGR5）和法尼醇X受体（FXR）的激活可改善代谢并发挥抗肥胖作用。
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。肥胖引起的肠道微生物群紊乱增加了一些含有LPS的细菌丰度，并导致肠道通透性增加；因此，LPS不能通过肠粘膜屏障进入血液，导致内毒素血症、大量促炎反应和炎性细胞因子的释放。值得注意的是，用SZ-A处理后，HFD诱导的肥胖小鼠肠粘膜屏障可以修复，这与观察到的Akk丰度增加一致，表明用SZ-A处理可以通过调节HFD引起的菌群紊乱来缓解低度炎症，改善代谢紊乱，并减轻体重。Akk在炎症性肠病（IBD）的研究中起着重要作用。在IBD患者中，Akk的数量显著减少，而其他肠道粘液降解细菌的总量增加，这表明Akk具有其他细菌可能没有的抗炎作用。先前的研究证实，Akk具有促进杯状细胞增殖、改善肠黏膜和肠道炎症的功能，这与H&E的结果一致。Akk是肠道中的一种黏蛋白降解细菌，主要定植于胃肠道的外部黏液层。它以胃肠道的黏蛋白作为其生长的碳和氮的来源。它的黏蛋白消耗和杯状细胞再生可以实现动态平衡，从而保持黏液层的稳定性。Akk可以加速肠上皮再生，促进肠上皮细胞发育，维持肠道稳态。Akk分泌的小泡可以减少Toll样受体4的表达，从而调节NF-κB通路，减少促炎因子IL-6和IL-8的分泌。
代谢组学结果表明，口服SZ-A可以显著改善HFD诱导的肥胖小鼠的代谢紊乱，其中二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳四烯酸（DHA）、α-亚麻酸和lipocholic acid（LCA）以及其他不饱和脂肪酸与HFD组相比显著增加。许多研究表明，不饱和脂肪酸可以调节炎症相关蛋白和NF-kB的表达，减少炎症，提高胰岛素敏感性，减少饥饿，改善肥胖。除了调节胆固醇、甘油三酯和脂溶性维生素的分泌和吸收外，胆汁酸还起到信号分子的作用，通过激活G蛋白偶联受体5（TGR5）和法尼醇X受体（FXR）来改善代谢并发挥抗肥胖作用。总之，本研究表明，口服SZ-A可以通过调节HFD小鼠的肠道微生物群来改善代谢紊乱的症状。
结论
在本研究中，我们探究了SZ-A在HFD诱导的肥胖小鼠中调节代谢紊乱和维持肠道微生物群的作用。结果表明，SZ-A可以改善肥胖症状，与HFD组相比，体重、总脂肪、血清总胆固醇和低密度脂蛋白显著降低。SZA处理后，肠道微生物群的改善使厚壁菌门和拟杆菌门的水平保持在合理的水平，而嗜黏蛋白阿克曼菌和双歧杆菌丰度的增加也有助于HFD诱导的肥胖小鼠的体重减轻。此外，SZ-A通过调节氨基酸、不饱和脂肪酸、胆汁酸和其他代谢途径来调节肥胖小鼠的代谢紊乱。总之，SZ-A可以通过改善肠道微生物群和代谢来改善肥胖小鼠的肥胖和代谢障碍适应症，有望成为治疗代谢综合征的创新药物。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37063280/
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