三所中医药大学联合发文:基于中医药整合药理学和转录组学探究丹栀逍遥散防治焦虑肝郁化火证的作用机制
采用高架十字迷宫实验测试动物焦虑程度。高架十字迷宫实验器材由2个开放臂（0.35 m×0.60 m）、2个封闭臂（0.35 m×0.60 m）以及交叉连接部（0.05 m×0.05 m）的开阔平台组成。封闭臂有0.15 m高的黑色挡板，十字迷宫平台离地面0.5 m。保持昼夜节律的光暗调整，实验室在实验过程中保持无灯光状态，开始将大鼠面向开臂放在高架十字迷宫的交叉连接部中央，同时开始软件记录大鼠在高架十字迷宫实验平台的运动轨迹以及在不同部位的时间和次数。①进入开放臂次数（open arm entry，OE）：即进入到任一开放臂的次数，以大鼠4只爪子均进入到臂内为准，中途1只爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成。②进入开放臂时间（open arm time，OT）：即进入开放臂的时间（s）。③进入封闭臂次数（close arm entry，CE）：即进入任一封闭臂的次数，以大鼠4只爪子均进入到臂内为准。④进入封闭臂时间（close arm time，CT）：即进入封闭臂的时间（s）。由以上指标计算进入开放臂次数比例（OE%）、开放臂停留时间比例（OT%）。上述记录由SuperMaze动物行为学视频分析系统完成，以排除测试过程的人为干扰因素。每次测试结束后清除粪便，并用75%乙醇清理迷宫，以掩盖气味。待乙醇蒸发后方可开始下1只动物实验。
OE%＝OE/(OE＋CE)
OT%＝OT/(OT＋CT)
1.10 qRT-PCR验证
1.10.1 主要仪器和材料 CFX Connect Real-Time System荧光定量PCR仪（美国Bio-rad），D3024R型离心机（美国SCILOGEX），Analytikjena-Easycycler普通PCR仪（德国Analytik Jena），Scandrop100型超微量核酸蛋白测定仪（德国Analytik Jena），移液器（美国Bio-rad），M2全自动加样仪（四川科劲生物科技有限公司）。TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit反转录试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，货号pc70）；2×SYBR® Green预混液（成都丹凤科技有限公司，货号DF001）。
1.10.2 qRT-PCR实验 各组大鼠麻醉后取脑组织，在冰块上分离海马组织和前额叶皮质，然后将海马组织、前额叶皮质和剩余脑组织分别装于1.5 mL离心管，迅速在液氮中冻存，放置于−80 ℃冰箱保存，委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成测序验证。
提取对照组、丹栀逍遥散组和模型组大鼠海马组织的总RNA，采用SYBR GREEN I检测对照组、模型组和丹栀逍遥散组大鼠海马组织RNA样品3个目的基因腺苷酸环化酶5（adenylate cyclase 5，ADCY5）、谷氨酸离子型受体NMDA型亚基2A（GRIN2A-glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A Gene，GRIN2A）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的mRNA表达量，用2−ΔΔCt方法计算各基因mRNA相对表达量。以磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因，所有实验共进行3次，引物合成信息见表2。
1.11 统计分析
采用SPSS 26.0软件进行分析，计量资料以表示。两两比较若方差齐则采用LSD检验，若方差不齐，使用Dunnett T3检验方法。组间比较若方差齐采用单因素方差One way ANOVA分析；若方差不齐采用Dunnett-t检验。P＜0.05表示差异有统计学差异。数据图采用生信工具-仙桃学术（https://www.xiantao.love/products）绘制。
2 结果
2.1 丹栀逍遥散成分靶标预测及分析
通过TCMIPV2.0平台对丹栀逍遥散化学成分的分析结果可知，共包含430种成分，候选靶标520个。对候选靶标进行基因功能分析和通路富集分析，发现其功能大多与谷氨酸受体信号通路、谷氨酸代谢过程、离子型谷氨酸受体信号通路、视黄醇代谢过程、L-谷氨酸转运、兴奋性突触后电位、γ-氨基丁酸信号通路正向调节密切相关，排名前20的功能和通路如图1所示。
2.2 焦虑疾病靶标及相关基因
对全疾病相关潜在靶标合并去重后，共获得209个，其中与丹栀逍遥散密切相关的共同靶基因共13个，分别是长链酯酰辅酶A合成酶4（Acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、ADCY5、醛脱氢酶5家族成员A1（aldehyde dehydrogenase 5 family member A1，ALDH5A1）、ATP酶Na+/K+转运亚基α3（ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 3，ATP1A3）、钙敏感受体（calcium sensing receptor，CaSR）、儿茶酚-O-甲基转移酶（catecholO-methyltransferase，COMT）、D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAO）、GRIN2A、GNAS （GNAS complex locus）、PI3K催化亚基p110alpha的编码基因（PIK3CA）、转化生长因子受体2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、核受体亚家族3 C组成员1（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）。
2.3 潜在靶点PPI分析
通过对13个靶点进行PPI分析，PIK3CA、ACSL4、ALDH5A1与其他靶标无关联性。其他10个靶标体现出较高的中心度，其中以ESR1为主，见图2。故在后续的验证中优先验证ADCY5、ATP1A3、CASR、COMT、DAO、GRIN2A、GNAS、TGFBR2、ESR1、NR3C1。
2.4 丹栀逍遥散防治焦虑的“中药-靶点-通路”多维网络分析
TCMIP v2.0平台采用人工智能、数据挖掘、网络计算及可视化等方法和技术，形成7大整合药理学分析模块，包括疾病相关分子集及其功能挖掘、证候相关分子挖掘及功能分析、中药（含方剂）靶标预测及功能分析、中药药性相关分子挖掘及功能分析、组方用药规律分析、中医药关联网络挖掘和反向查找中药（含方剂）。丹栀逍遥散防治焦虑的“中药-靶点-通路”多维网络图是基于“中医药关联网络挖掘”构建，根据中药方剂、中药材、中药成分、核心靶标、通路、疾病和证候之间的关联性，可任意选择不同类型的节点，构建中药多维关联网络[17]。
如图3所示，图中五角星表示方剂丹栀逍遥散，正方形表示中药，圆形表示靶标，椭圆形表示肝郁化火证临床表型，三角形表示丹栀逍遥散防治焦虑肝郁化火证的相关通路。通过网络图可以一目了然地发现丹栀逍遥散防治焦虑肝郁化火证的关键网络靶标及其作用机制，有助于揭示其科学内涵。
2.5 核心靶点微阵列芯片验证结果
最终选定微阵列芯片数据集GSE4035。该数据集基于GPL1261 [Mouse430_2] Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array阵列平台，包含12例焦虑RNA样本（组2）和12例健康RNA样本（组1）。
由图4可见，基因表达谱区分度良好，保证了后续差异表达分析的准确性。去掉空值后的ID总数为20 814个，满足 |log2(FC)|＞1和Padj＜0.05阈值的ID有972个，在这阈值下，组2中高表达（log2FC为正）的数目有501个，组1中高表达（log2FC为负）的数目有471个；组间差异基因火山图见图5，热图见图6。
GSE4035数据集的差异表达基因与ADCY5、ATP1A3、CASR、COMT、DAO、GRIN2A、GNAS、TGFBR2、ESR1、NR3C1得到3个交集基因，分别是ESR1、GRIN2A和ADCY5，证明了上述分析的可靠性。
2.6 动物实验验证结果
2.6.1 一般情况和体质量 造模期间，丹栀逍遥散组与对照组的大鼠皮毛光泽顺滑，二便正常，日常活动灵敏。模型组大鼠变得较为暴躁，皮毛光泽暗淡。对照组大鼠体质量增长较快，丹栀逍遥散组和模型组大鼠的体质量增长较缓，与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
2.6.2高架十字迷宫实验 如图7所示，在OT%方面，模型组低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；丹栀逍遥散组高于模型组，差异不具有统计学意义（P＝0.069）。在OE%方面，模型组高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；丹栀逍遥散组低于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
2.6.3 qRT-PCR实验结果 样品中ESR1 mRNA表达丰度低，有些样本没有Ct值，无法进行后续计算。与对照组比较，模型组ADCY5 mRNA表达量升高，但差异无统计学意义（P＝0.056 7），GRIN2A mRNA表达量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，丹栀逍遥散组ADCY5 mRNA表达量显著降低（P＜0.05），GRIN2A mRNA表达量显著升高（P＜0.001）（图8）。表明这2个核心靶点基因的相对定量值与整合网络药理学的数据趋势一致，证明整合网络药理学和GEO数据挖掘结果的可靠且重复性好。
3 讨论
3.1 焦虑肝郁化火证中医病机与治疗策略
焦虑属于中医“郁”的范畴。南宋的陈言提出“脏气不行，郁而生涎……皆七气所生所成”，郁是疾病发生的罪魁祸首，郁既有病的概念，也是证的范畴；明清时期，“郁”多被单列一门，《医学正传》首用“郁证”作为病名进行论述[5]。但对于“郁”的治疗不仅是疏散之法，有研究显示古代医家治疗郁多以“培土”为基础，辅以疏肝，酌用清热、行气、安神之品[6]。
通过焦虑肝郁化火证的临床证候表型可以看出，焦虑肝郁化火证患者实际临床中往往呈现虚实夹杂，本虚标实，阴虚阳亢的病机，譬如运动性紧张、坐卧不宁、紧张性头痛、颤抖、心动过速或呼吸急促、无法放松属于虚阳外亢的临床表现；担忧、注意困难、头重脚轻、出汗、头晕、口干属于正虚的临床表现。丹栀逍遥散组方和功效划分恰好符合焦虑肝郁化火证的整体病机，其中丹皮、栀子清热泻火治疗阳亢于外，茯苓、炒白术、炙甘草建中补脾治疗脾气亏虚，当归、白芍、柴胡养血柔肝补肝体而疏肝用。总体而言，焦虑肝郁化火证涉及主要病位在肝、脾，主要病性虚、实，丹栀逍遥散的组方符合焦虑肝郁化火证的发病机制。本研究借助TCMIP v2.0平台，从中药成分、证候要素、疾病靶点的多层次研究以及从药物自身出发，较为全面地展现了中药-证候-疾病-靶标-通路的衔接性研究，形成中医药现代研发体系，从分子角度解释了中医药疗效内涵[18]。
3.2 整合网络药理学结果分析
丹栀逍遥散化学成分分析，谷氨酸受体包括离子型受体和代谢性受体，离子型谷氨酸受体包括N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid，AMPA）受体和Kainate受体；应激状态时，NMDARs会被过度激活，Ca2+通道反复开放，过多的Ca2+内流使细胞内Ca2+超载，引起神经细胞死亡[19]。应激状态下，上调的AMPAR增加了脑内谷氨酸兴奋性毒性，出现细胞内钙累积，导致细胞稳态的破坏和脑组织的结构损伤[20]。代谢型谷氨酸2型受体和γ-氨基丁酸B受体属于C家族G蛋白偶联受体，分别是兴奋性神经递质谷氨酸和抑制性神经递质γ-氨基丁酸的代谢型受体，γ-氨基丁酸B受体在中枢神经系统中介导缓慢的抑制性神经传导和突触可塑性调控，其活性的失调会导致细胞功能紊乱、损伤甚至细胞凋亡[21]。
“中药-靶点-通路”多维网络分析显示，丹栀逍遥散通过调控AMPA受体、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、AMPA受体的转运、胰高血糖素信号中的PKA激活、NMDA受体激活、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信号通路，对蛋白质结合、胞质溶胶、质膜、细胞质、线粒体等通路进行干预。
ADCY5是一种腺苷酸环化酶，通过合成第2信使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）来介导G蛋白偶联受体的信号传导。此外，cAMP也是一种典型的第2信使，其通过浓度的变化响应细胞外信号与细胞表面受体的结合，调节细胞内酶和非酶蛋白的活性，激活依赖于cAMP的PKA表达增加磷酸化水平，并调节BDNF等基因的表达，从而发挥生物学效应[22]。
GRIN2A是重要的谷氨酸离子向受体NMDA型亚基，焦虑样行为与海马中GRIN2A的上调有关，可通过调节与Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium-calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）的结合来影响突触的可塑性[23]。DAO是一种降解D-丝氨酸的酶，是NMDAR的主要内源性共激动剂，灭活或缺失DAO将会加剧焦虑[24]。
雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）二核苷酸重复等位基因与90项症状清单（symptom check list 90，SCL-90）9个亚分数和总分之间的关联结果显示，其与SCL-90评分中焦虑、恐惧焦虑和总症状有显著关联[25]。已有的研究表明，ESR1变异与认知结果之间具有密切关系，初步证据表明ESR1基因在某些情绪中的作用，发现ESR1多态性与焦虑或抑郁症状关联显著[26]。
本研究旨在探讨丹栀逍遥散治疗焦虑的本质，完善和补充现有的研究。目前有诸多学者对丹栀逍遥散治疗焦虑展开了深入研究，在生物学机制方面丹栀逍遥散可以显著降低焦虑大鼠炎症反应、机制细胞凋亡和和减轻护神经元损伤以及提高线粒体功能、提高脑源性神经营养因子和蛋白激酶蛋白表达，促进脑源性神经营养因子分泌，从而改善焦虑样行为。初步阐明了丹栀逍遥散治疗焦虑症的作用机制和主要成分协同作用的机制，同时支撑了丹栀逍遥散在防治疗焦虑症方面的应用。
3.3 GEO数据库验证结果分析
GEO数据库中转录组学验证结果显示，ESR1、ADCY5、GRIN2A与焦虑肝郁化火证密切相关。雌激素在很大程度上通过其主要的ESR1和ESR2的细胞内激活来发挥其生物学作用。因此，雌激素受体的遗传变异可能会改变雌激素信号，从而影响女性患者抑郁症的易感性[27]。也有研究显示，5-羟色胺基因与ESR1基因多态交互作用可能增加女性围绝经期抑郁障碍患病的风险[28]。进一步验证了ESR1基因是核心靶点基因之一。
ADCY5可以通过调节BDNF基因的表达进而对谷氨酸损伤的神经元具有保护作用，BDNF可增加谷氨酸损伤皮层神经元NMDAR1 mRNA及蛋白的表达，增强其NMDA受体活性。同时GRIN2A是谷氨酸离子向受体NMDA型重要亚基，亦影响着NMDA受体的活性。因此，推测丹栀逍遥散可能是通过下调ADCY5和上调GRIN2A基因的表达水平进一步上调BDNF表达和增加NMDA活性，发挥其生物学效应。
3.4 动物实验验证结果分析
高架十字迷宫实验结果显示，在OT%方面，虽然丹栀逍遥散组高于模型组，差异不具有统计学意义（P＝0.069），但通过统计结果可以看出具有明显的趋势，其原因可能与样本量少有关。在OE%方面，丹栀逍遥散组与模型组差异均具有统计学意义，说明丹栀逍遥散能改善焦虑模型大鼠进入开放臂的次数。
核心靶点基因验证结果显示，ADCY5和GRIN2A mRNA表达量模型组与对照组、丹栀逍遥散组与模型组差异均具有统计学意义；核心靶点经qPCR实验验证，丹栀逍遥散能降低ADCY5 mRNA表达（P＜0.05），升高GRIN2A mRNA的表达（P＜0.001）。
4 结论
本研究对丹栀逍遥散组方候选靶标与焦虑症进行关联并以网络可视化形式展现，并预测其可能靶标和分子信号通路。丹栀逍遥散调控的主要通路有AMPA受体的激活、PKA激活、胰高血糖素信号中的PKA激活、NMDA受体激活、PI3K/Akt等。中医药整合药理学和GEO数据集获取交集基因，包括ESR1、ADCY5、GRIN2A基因；丹栀逍遥散可能通过上调ADCY5 mRNA表达和下调GRIN2A mRNA表达进一步调节BDNF表达和NMDA活性，进而调节BDNF与其受体的结合和NMDA活性，从而调节BDNF与其受体结合，进一步改善神经元生长、突触传导与突触的可塑性，从而发挥其生物学效应。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：潘赐明，任 雪，韦姗姗，曹蓓苓，王 维，杨 艳，陈文慧，徐宏喜．基于中医药整合药理学和转录组学探究丹栀逍遥散防治焦虑肝郁化火证的作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(12):3911-3920.
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