肝纤维化是在各种慢性损肝因素的作用下，损伤与修复过程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和降解不平衡，最终导致ECM在肝内过度沉积所致。肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理基础[1]。肝硬化和终末期肝病已是全球健康负担和致死的主要原因之一[2]。如何有效防治及逆转肝纤维化一直是当今世界医学热点和难题，但迄今还没有理想的抗肝纤维化生物或化学药物，中医药治疗肝纤维化有较好的疗效，近年来备受关注[3]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路参与调节细胞增殖、凋亡、自噬和炎症等多种细胞过程，与肝纤维化密切相关[4-5]。课题组长期采用扶肝化纤汤治疗肝纤维化并取得较好临床疗效，前期研究发现该方可能通过调控p-JNK、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p38蛋白表达，抑制有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路延缓肝纤维化大鼠的肝脏病理进展[6]，但尚未对扶肝化纤汤调节MAPK信号通路是否介导了肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）的活化增殖过程进行探讨。因此，本研究以HSC-T6细胞为对象，加入5 ng/mL转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导建立体外肝纤维化模型，探究扶肝化纤汤含药血清对HSC-T6细胞活化增殖、JNK信号通路和炎症因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，为进一步开发和临床应用提供基础。
1 材料
1.1动物
清洁级雄性SD大鼠40只，体质量（200±20）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证编号SCXK（湘）2019-0014。动物饲养于贵州中医药大学甲秀校区动物实验中心，自然采光，通风，室温18～20 ℃，自由进食饮水。动物实验经贵州中医药大学第二附属医院伦理委员会批准（批准号20210035）。
1.2细胞
HSC-T6细胞购自北京北纳创联生物技术研究院。
1.3药材
扶肝化纤汤由黄芪20 g、当归20 g、白芍20 g、鳖甲20 g、丹参20 g、白术20 g、枳实15 g、黄精15 g、柴胡10 g、绞股蓝10 g、炙甘草6 g、三七5 g组成，以上药材均购自贵州中医药大学第二附属医院中药房，由贵州中医药大学第二附属医院药学部杨亮副主任药师分别鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根、伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲、唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎、菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎、芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果、百合科植物黄精Polygonatum sibiricum Red的干燥根茎、伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根、葫芦科植物绞股蓝Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino的全草、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根和根茎的蜜炙法加工品、五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen的干燥根和根茎，符合《中国药典》2020年版规定。
1.4 药品与试剂
DMEM培养基（批号11995065）、胎牛血清（批号10099141）购自美国Gibco公司；TGF-β1（批号0713AF354K1115）购自美国Peprotech公司；胰蛋白酶（批号C0201）、CCK-8试剂盒（批号C0039）、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（批号A0208）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均购自碧云天生物技术有限公司；IL-1β ELISA试剂盒（批号202211）、IL-6 ELISA试剂盒（批号202206）、TNF-α ELISA试剂盒（批号202206）购自江苏晶美生物科技公司；qRT-PCR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成；RNAiso plus（批号9109）购自日本Takara公司；p-JNK兔抗（批号4468S）购自美国CST公司；α-SMA鼠抗（批号ab7817）、FITC标记的α-SMA抗体（批号ab7817）、Alexa Fluor二抗（批号ab6785）购自英国Abcam公司；β-actin兔抗（批号380624）购自杭州华安生物技术有限公司；JNK抑制剂SP600125（批号SP60012501）购自美国Selleck生物科技有限公司。
1.5 仪器
Varioskan LUX多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Stepone plus qRT-PCT仪（美国Applied Biosystems公司）；170-3930型Trans-Blot转印槽（美国Bio-Rad公司）；Tanon-1600型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；SP8型激光共聚焦荧光显微镜（德国Leica公司）。
2方法
2.1 扶肝化纤汤的制备
按处方配比称取药材，加水浸泡1 h，用10倍量水煎煮2次（第1次多加2倍量水），每次1 h，滤过，滤液浓缩至1 g/mL的药液。扶肝化纤汤中黄芪、柴胡为君药，其主要药效成分为黄芪甲苷和柴胡皂苷。经高效液相色谱测定，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、柴胡皂苷A的质量浓度分别为0.093、0.038、0.029 mg/mL。
2.2扶肝化纤汤含药血清的制备
据动物与成人每千克体质量剂量折算系数6.25计算大鼠中药临床等效量[7]，即扶肝化纤汤给药剂量为18.75 g/kg。大鼠随机分为正常组和给药组，给药组ig药物，正常组ig等体积生理盐水，1次/d，连续1周。给药结束后，大鼠麻醉，腹主动脉采血，4 ℃静置分离2 h，4 ℃、3000 r/min离心10 min，取上清，合并同组血清。将血清密封用隔水薄膜包装后，置于56 ℃恒温水浴锅内灭活30 min，再经0.22 μm滤膜滤过除菌，于−20 ℃保存备用。
2.3细胞培养及分组
HSC-T6细胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，2～3 d更换细胞培养液，观察细胞贴壁情况。设置对照组（含15%正常血清的培养基）、模型组（含15%正常血清的培养基）、扶肝化纤汤含药血清组（含15%扶肝化纤汤含药血清的培养基）和JNK抑制剂组（含15%正常血清和20 μmol/L SP600125的培养基），模型组和各给药组加入TGF-β1（5 ng/mL），各给药组加入药物干预24 h后进行相关检测。
2.4 CCK-8法检测扶肝化纤汤含药血清对细胞存活率的影响
取3～5代HSC-T6细胞，以2×104/孔接种于96孔板中，设置对照组、模型组和含药血清（5%、8%、10%、15%、20%）组，对照组加入200 μL含10%胎牛血清的培养基，其余组加入1 μL TGF-β1（终质量浓度为5 ng/mL），含药血清组分别加入190 μL不同体积分数的含药血清培养24 h，酶标仪测定450 nm处的吸光值（A）值，计算细胞存活率。
2.5 ELISA检测细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平
按“2.3”项下方法处理细胞，收集上清液，4 ℃、1200 r/min离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定IL-1β、IL-6和TNF-α水平。
2.6Western blotting检测p-JNK和α-SMA蛋白表达
按“2.3”项下方法处理细胞，收集细胞，PBS洗涤2次，加入裂解液于冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后，加入一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入二抗（1∶5000），室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL化学发光法显色，于凝胶成像仪中观察并拍照。
2.7qRT-PCR检测JNK和α-SMA mRNA表达
按“2.3”项下方法处理细胞，收集细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：GAPDH上游引物5’-GATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3’、下游引物5’-GTCAATGAAGGGGTCGTTGA-3’；JNK上游引物5’-GGAGCGAACTAAGAATGGCG-3’、下游引物5’-ACTGCTGTCTGTATCCGAGGC-3’；α-SMA上游引物5’-GGCATCCACGAAACCACCT-3’、下游引物5’-CCGCCGATCCAGACAGAATA-3’。
2.8免疫荧光法检测α-SMA的蛋白表达
24孔培养板中放入制备好的盖玻片，细胞接种至盖玻片上进行培养，按“2.3”项下方法处理细胞，加入一抗、二抗孵育，含抗荧光淬灭剂封片，激光扫描聚焦显微镜下采集图像。
2.9统计学分析
采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用Shapiro-Wilk（S-W）法进行正态分布检验，数据以表示。多组间差异采用单因素方差分析，满足正态分布且方差齐的数据用Bonferroni检验进行组间两两比较，方差不齐先用Welch检验进行总体均值比较，再用Dunnett’sT3检验进行两两比较。
3 结果
3.1扶肝化纤汤含药血清对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞形态的影响
如图1所示，对照组细胞伸展生长，透光度好，呈扁圆形。模型组细胞变长，胞体变大，胞质内折光颗粒减少，部分细胞融合成片状，符合激活型HSC表现；扶肝化纤汤含药血清组和JNK抑制剂组均可抑制HSC-T6细胞生长，细胞趋向表现为静止型HSC。
3.2扶肝化纤汤含药血清对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖的影响
如表1所示，与模型组比较，5%、8%、10%、15%、20%的扶肝化纤汤含药血清对TGF-b1诱导的HSC-T6细胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），以15%、20%含药血清抑制作用最佳，两组之间无显著性差异，选择15%含药血清进行后续实验。
3.3 扶肝化纤汤含药血清对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响
如表2所示，与对照组比较，模型组细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著降低（P＜0.05）。
3.4扶肝化纤汤含药血清对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞p-JNK和α-SMA蛋白表达的影响
如图2和表3所示，与对照组比较，模型组p-JNK、α-SMA蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组p-JNK、α-SMA蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。
3.5扶肝化纤汤含药血清对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞JNK和SMA mRNA表达的影响
如表4所示，与对照组比较，模型组JNK、α-SMA mRNA表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组JNK、α-SMA mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。
3.6免疫荧光法检测各组α-SMA的表达
如图3所示，TGF-β1诱导后的HSC-T6细胞呈活化态，α-SMA在细胞核内表达。与对照组比较，模型组α-SMA绿色荧光数量增多；与模型组比较，各给药组α-SMA绿色荧光数量减少。
4 讨论
JNK激活参与了炎症损伤、伤口愈合等过程中各种细胞的应激反应，并参与毒性、代谢性、自身免疫性和肿瘤性等肝病损伤的调节，JNK信号激活可以促使静默的HSC转化为肌成纤维细胞[8]。研究显示在肝纤维化动物模型中JNK表达明显升高，且主要富集在肌成纤维细胞中，拮抗JNK表达后可以缓解肝纤维化动物模型的肝脏纤维化程度[9]，细胞实验中还发现JNK抑制剂阻止了TGF-β、血小板衍生生长因子等细胞因子诱导的小鼠HSC活化。
诸多研究证实了JNK信号通路与肝纤维化的密切关系，JNK主要位于细胞质，在细胞因子IL-1β、TNF-α等刺激下发生核转位，进入细胞核级联激活相应核内转录因子而被磷酸化激活，促进c-Jun及其下游基因转录和蛋白表达，进一步释放致炎细胞因子，放大炎症损伤，参与肝纤维化的发生、发展，在肝脏疾病发病中有关键作用[9]。IL-1对HSC活化中具有关键作用，并调节肝损伤引起的纤维化的发展，已经确定了IL-1家族表达与肝纤维化严重程度呈正相关[10]。IL-6主要由巨噬细胞和Th2细胞产生，其与TNF-α作为促炎介质，高表达水平可导致肝细胞坏死，参与肝损伤期间的炎症过程[11]。Li等[12]研究发现川陈皮素通过靶向JNK信号通路诱导肝细胞凋亡来保护急性肝损伤。Cubero等[13]研究发现Myostatin通过JNK信号激活肝星状细胞的成纤维表型发生增殖活化，其JNK蛋白直接激活HSC，促进I型胶原纤维形成，使α-SMA表达增多。González-Vázquez等[14]研究发现JNK信号通路抑制剂可以有效抑制肝星状细胞的增殖活化从而达到抗肝纤维化的作用。这些研究表明抑制JNK信号通路可能实现抗肝纤维化作用。
肝纤维化与中医学“肝癖”“肝着”“积聚”等病内涵相似，中医认为肝脾密切相关，生理上，肝主疏泄，脾主运化；肝藏血，脾统血。脾为气血生化之源，脾得肝之疏泄，则升降协调，运化健旺，气血生化有源，肝血充足则肝有所藏，肝体得以濡养，才会肝气冲和条达，疏泄正常。即所谓“土得木而达”“木赖土以培之”“培土荣木”。《难经·第七十七难》中言：“肝病当传之于脾，故先实其脾气”，仲景承其思想，在《金匮要略》里有云：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾，……故实脾，则肝自愈。此治肝补脾之要妙也”。叶天士曰“补脾必以疏肝，疏肝即以补脾也”。因此在慢性肝病中，强调“从脾论治、培土荣木”[16]。扶肝化纤汤由黄芪、当归、白芍、鳖甲、丹参、白术、枳实、黄精、柴胡、绞股蓝、炙甘草、三七粉组成，临床用于肝纤维化治疗效果明显，前期实验表明[6,16-17]，扶肝化纤汤可保护肝细胞、改善肝功能、控制肝纤维化进展。其机制可能是通过影响TGF-β1/Smad信号转导通路，抑制TGF-β1诱导的HSC的活化增殖发挥抗肝纤维化作用。本次实验再次验证扶肝化纤汤含药血清可抑制HSC的活化增殖，能够显著下调活化HSC的JNK、α-SMA mRNA表达，降低了活化HSC的p-JNK和α-SMA蛋白水平，抑制炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放。通过调控JNK信号通路抑制HSC活化增殖，减少炎症介质分泌，继而减少ECM的合成，可能是扶肝化纤汤抗肝纤维化的可能机制之一。但肝纤维化病因病机复杂，介导的细胞信号通路众多，而中药复方制剂往往又具有多层面、多靶点、多途径的作用特性，因此，扶肝化纤汤抗纤维化的作用机制值得进一步研究探讨。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：肖政华，李婷婷，石以石则，杨庆万，李珊珊．基于JNK信号通路探讨扶肝化纤汤对肝星状细胞活化增殖的影响 [J]. 中草药, 2023, 54(16):5283-5288.
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