结构疏水性对阳离子两亲性聚集-诱导发射光敏剂-细菌相互作用和光动力效率的作用
病原菌感染严重威胁着全球公众的健康。通过空气、水、食物和活媒介的不同传播途径使细菌感染不可避免。为了应对细菌感染，我们严重依赖可杀死或抑制细菌在人体内生长的抗生素;然而，抗生素的误用和过度使用导致细菌产生耐药性。世界卫生组织(World Health Organization)已将抗微生物药物耐药性归类为一种广泛的严重威胁，不再是未来的预测；它现在正在世界每个地区发生，并有可能影响任何国家、任何年龄的任何人。2019年，全球归因于抗微生物药物耐药性的死亡人数达到127万人。因此，寻找在不引起抗生素耐药的情况下对抗细菌感染的替代方法是研究人员的一项紧迫而重要的任务。
基于此，香港中文大学（深圳）唐本忠院士、深圳大学王东教授和香港科技大学Ryan T. K. Kwok教授合作设计并合成了一系列具有不同计算对数P值的阳离子两亲性AIE ps（图1）。然后，研究者系统地研究了AIE PS的疏水性变化与细菌靶向性的关系、标记不同种类细菌所需的AIE PS剂量以及它们的光动力抗菌效率。本研究的发现有助于更好地理解尚不清楚的AIE PS与细菌的相互作用机制，并为阳离子型两亲性AIE PS的结构设计策略提供一些见解，从而更好地发展细菌诊疗。相关工作以 “The Role of Structural Hydrophobicity on Cationic Amphiphilic Aggregation-Induced Emission Photosensitizer-Bacterial Interaction and Photodynamic Efficiency”发表在《ACS Nano》。
图1. TTVP-Am、TTVP-Bu、TTVP-Tol、TTVP-Nap的化学结构及计算log P值
AIE ps的合成及其光物理性质
研究者首先研究了TTVP光物理性质。如图2A所示，无论吡啶尾部疏水性的变化如何，四个AIE PSs在DMSO溶液中的吸收几乎相同。TTVP-Am、TTVPBu、TTVP-Tol和TTVP-Nap的最大吸收峰分别位于487、482、488和490 nm。图2B显示了用DMSO和甲苯作为溶剂混合物对四种分子的AIE考察，其中DMSO是化合物的好溶剂，甲苯是化合物的坏溶剂。所有化合物在DMSO中都是弱发射的，在DMSO中它们完全溶解为分离的分子，但当溶剂混合物中的甲苯分数从0上升到95 vol %时，它们的荧光强度急剧增加。TTVP-Am、TTVP-Bu、TTVP-Tol和TTVP-Nap聚集体的最大发射峰分别在661、645、646和651 nm。如图2C所示，与100% DMSO溶液相比，TTVP-Am(95%甲苯组分)、TTVP-Bu(99%甲苯组分)、TTVP-Tol(99%甲苯组分)和TTVP-Nap(99%甲苯组分)的最强光致发光(PL)强度分别提高了98倍、78倍、99倍和100倍。这些实验证实了它们的AIE特性。单分子态的猝灭发射归因于三苯胺和吡啶基团的旋转运动，通过非辐射衰变耗散激子的激发能，而在溶剂混合物中甲苯的比例较高时诱导形成纳米聚集体。在聚集状态下，它们的分子内运动受到极大的限制;因此，禁止了非辐射衰变，促进了强荧光发射的辐射路径。此外，这些AIE ps的供电子和接受电子特性有助于分子内电荷转移，从而赋予它们更长的波长。此外，D - A元素有助于TICT效应，如图2D中所示的溶剂着色效应。使用不同极性的溶剂，包括甲苯，四氢呋喃，氯仿，乙醇，甲醇和二甲基亚砜来研究溶剂变色的性质。随着溶剂极性的降低，所有AIE ps的发射峰均发生蓝移。对于TTVP-Am、TTVP-Bu、TTVP-Tol和TTVP-Nap，固态发射最大值分别为660、681、676和731 nm(图2E)。
图2. AIE ps的光物理性质及ROS生成测定
阳离子两亲性AIE ps处理革兰氏阳性细菌
通过荧光成像系统研究了AIE PS与细菌之间的相互作用。本文选取金黄色葡萄球菌作为研究的革兰阳性菌模型。金黄色葡萄球菌被不同剂量(0.125、0.5、1、5和10 μM)的四种AIE聚集物孵育15分钟后的共聚焦激光扫描显微镜成像如图3A、B所示。从一系列共聚焦成像中，我们发现结构疏水性改变的AIE PS表现出不同的细菌染色结果，包括(1)细菌包膜靶向效率的偏差，(2)细菌细胞通透性随剂量变化的不同程度，(3)不同程度的AIE聚集体形成和扩大，以及(4)细菌聚集现象的梯度。
图3. AIE PSs (TTVP-Am, TTVP-Bu;TTVP-Tol和TTVP-Nap)和革兰阳性金黄色葡萄球菌之间的相互作用现象。
阳离子两亲性AIE ps处理革兰氏阴性细菌
接下来，研究者研究了阳离子性两亲性AIE ps与革兰阴性菌之间的相互作用。大肠杆菌被用作革兰阴性菌模型。如图4A和S41 - S44所示，使用不同浓度的AIE PS(1、5和10 μM)与大肠杆菌孵育细胞15 min。对AIE PS和革兰阴性菌相互作用的具体观察发现:(1)染料菌逐渐相互作用，(2)染料聚集形成和增大，(3)细菌包膜靶向效率降低。
图4. AIE PSs (TTVP-Am, TTVP-Bu;TTVP-Tol和TTVP-Nap)和革兰阴性大肠杆菌之间的相互作用现象。
不同疏水性AIE PSs的靶向机制
为了从共聚焦成像结果中充分了解4种AIE ps的细菌亲和性，研究者进一步研究了不同剂量的TTVP-Am、TTVP-Bu、TTVP-Tol和TTVP-Nap与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌孵育后的PL发射强度差异和发射位移(图5A)。此外，研究者测量了不同剂量的AIE PS在没有细菌孵育的情况下的PL强度和单独细菌的PL强度作为参考。由于四种AIE ps呈D−A结构，其固有的TICT特性使其能够适应不同的分子构型，并表现出响应微环境极性的荧光颜色变化。TICT发射可以显示AIE PS在不同剂量和不同结构疏水性下的细菌亲和性位置。将不同浓度的AIE PS添加到PBS中，组成最终溶液，获得发射强度。混合移液管并等待15 min后，在488 nm激发下记录溶液的PL光谱。研究者发现，当浓度从1 μM增加到10 μM时，所有研究的AIE ps的发射强度普遍增加。特别是，由于TTVP-Am和TTVP-Bu的部分水溶性和在PBS中形成疏松的聚集体，它们的发射强度的增加几乎不明显。然而，由于较差的水溶性，TTVP-Tol和TTVP-Nap在PBS溶液中形成高密度AIE聚集体后，发射强度从1 μM显著增加到10 μM。除了发射强度的变化，在不同浓度的AIE PS中没有观察到最大发射波长的变化，这意味着AIE纳米聚集体和AIE PS个体之间的环境极性的变化很小到可以忽略不计。
图5. 研究AIE PSs (TTVP-Am、TTVP-Bu)的染色机制
光动力抗菌性质
研究者想知道结构疏水依赖的细菌靶向效率如何影响它们的细菌清除效率。用不同浓度(0、0.125、0.25、0.5、0.75和1 μM)的AIE PS处理金黄色葡萄球菌10 min，然后用功率密度为10 mW/cm2的白光照射8 min进行光动力处理。通过平板计数法定量细菌杀灭效率，如图6B和c所示。在无光照的情况下，1 μM AIE PS的细菌活力保持在90%以上。这表明所有研究的AIE ps对金黄色葡萄球菌具有较低的暗毒性。而接受8 min光照处理后，金黄色葡萄球菌的活力明显下降。特别是，经0.25 μM TTVP-Am处理后，超过90%的金黄色葡萄球菌被杀死。然而，在相同的条件和浓度下，TTVP-Bu、TTVP-Tol和TTVP-Nap分别只能杀灭75%、45%和15%的金黄色葡萄球菌。虽然TTVP-Am表现出最低的总ROS生成效率(图2I)，但我们的结果表明，TTVP-Am在光动力杀灭革兰阳性细菌方面表现最好。为了研究细菌杀灭机制，扫描电镜分析揭示了1 μM AIE PS光动力处理后金黄色葡萄球菌的形态(图6A)。未处理的金黄色葡萄球菌对照显示完整、光滑和明确的膜边界。而TTVP-Am或TTVP-Bu处理后的金黄色葡萄球菌形态明显扭曲，菌膜边界模糊、皱缩。同时，部分TTVP-Tolstained的金黄色葡萄球菌经白光处理后显示出不明确的细菌边界。TTVP-Nap和光照处理的金黄色葡萄球菌显示出与对照组相似的完整、明确的细菌结构。由于抗菌作用来源于产生的ROS对细菌包膜上的生物大分子的破坏和灭活43,44，因此相对亲水性的TTVP-Am和TTVP-Bu在光动力杀灭金黄色葡萄球菌方面优于疏水性的TTVP-Tol和TTVP-Nap。结果表明，具有较高细菌膜亲和性的亲水性AIE PS具有较好的光动力抗菌效果。
图6. TTVP-Am, TTVP-Bu, TTVP-Tol和TTVP-Nap对革兰阳性金黄色葡萄球菌的光动力杀菌研究
【小结】
综上所述，研究者设计并合成了一系列阳离子两亲性AIE PSs, TTVP-Am, TTVP-Bu, TTVPTol和TTVP-Nap，疏水性增加。尽管它们在光物理和光敏性质上有相似之处，但吡啶部分旁边的可调疏水性基团赋予了这些AIE ps不同的水溶性，这反映在它们的对数P值上。细菌相互作用机制研究表明，细菌标记效率随着AIE ps的log P值的降低而增加。此外，随着AIE PS浓度的增加，细菌通透性增加，但随着剂量的增加和AIE PS疏水性的增加，也观察到染料聚集体形成和细菌逐渐聚集。同时，对于革兰阴性菌的相互作用，AIE PS的疏水性降低，标记效率提高。然而，尽管疏水性不同，但没有一种AIE PS在低浓度时能够成功标记革兰阴性菌。相反，较高浓度的亲水性AIE ps可以成功标记革兰阴性菌，伴随轻度AIE纳米聚集体的形成，有助于部分细菌聚集。同时，光动力杀菌结果表明，尽管亲水性阳离子型AIE PSs的ROS生成效率略有差异，但它们的细菌相互作用行为最强，抗菌效果最佳。这一工作表明，阳离子型两亲性AIE PS的结构疏水率可能是AIE PS-细菌标记有效性的关键因素之一，这可能进一步影响光动力杀菌性能。这为未来阳离子两亲性AIE PS作为抗菌诊疗药物的设计策略提供了见解。
转自：“高分子科学前沿”微信公众号
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