ES&T | 匹兹堡大学高鹏助理教授：探索质谱法下的单细胞暴露组学

‍英文原题：Exploring Single-cell Exposomics by Mass Spectrometry

通讯作者：高鹏 (Peng Gao), 匹兹堡大学

作者：高鹏，美国匹兹堡大学环境与职业健康系及土木与环境工程系、美国匹兹堡大学医学中心希尔曼癌症中心

近日，匹兹堡大学高鹏助理教授在ES&T发表文章展望了由先进的质谱法驱动的单细胞暴露组学技术，揭示了细胞对环境压力的反应，为疾病研究和精准环境健康提供了方法可行性。

摘要

单细胞暴露组学是一种革命性的方法，研究细胞与环境在细胞和亚细胞水平上的相互作用，与传统的暴露组学有所不同。利用质谱法的进步，它提供了对细胞动态、相互作用以及对环境刺激的响应及其对人类健康影响的详细视角。本文深入探讨了这一创新领域，强调环境应激源与细胞和亚细胞水平的生物反应之间的微妙相互作用。文章还讨论了空间质谱法在单细胞暴露组学中的应用，揭示了单个细胞内的复杂空间组织和分子组成。此外，文章进一步强调了与分子和细胞生物学方法的整合，以在全面的生物背景下验证从单细胞暴露组学中得出的假设。文章还展望了将相关的技术进步，与其他组学方法的融合，以及对环境健康研究、疾病进展研究和精准医学的影响。最后的重点是认识到这一技术固有的复杂性，需要强大的计算工具和跨学科合作，从而充分利用单细胞暴露组学的潜力。

引言

在过去的二十年里，健康科学领域在理解环境暴露对人类健康影响的认知上发生了显著的进化。这主要是由暴露组的概念和迅速发展所推动的。作为一个新兴的学科，暴露组学正在加速环境健康科学的研究，致力于揭示导致人类表型和疾病易感性的暴露因素。另一方面，单细胞分析和各种尖端质谱法的结合为揭示单个细胞级别的环境暴露的复杂性提供了前所未有的机会。单细胞暴露组学的概念源于理解各种暴露如何独立影响每个细胞，进而影响其功能和发病潜力的必要性。以前的暴露组学分析已在诸如肾脏、肝脏、血液和尿液等的组织或生物样本上执行。然而，这种方法忽视了单个细胞的独特特性和反应。考虑到细胞反应的异质性，传统的整体级别分析可能会掩盖显著的变化并可能导致误导性的解释。随着单细胞技术的出现，这些界限得到了推动，使得探索细胞对环境暴露反应的异质性成为可能。例如，尽管环境暴露可能只影响生物体中的少数细胞，但仍然可能引发重大的健康变化，这在人群水平上评估时可能被忽视。单细胞暴露组学提供了显著的潜力，因为它提供了关于单个细胞如何响应环境刺激的见解，有助于理解疾病的发起、进展或预防。细胞与其环境的互动为理解生物体的整体健康和疾病状态奠定了基础。观察每个细胞如何响应环境刺激帮助我们揭示导致个体间疾病易感性和生物学反应差异的遗传和环境因素的相互作用。因此，本文强调了在暴露组学背景下对单细胞水平分析的迫切需要。然而，深入全面地探索疾病机制需要整合其他单细胞方法，如基因组学、蛋白质组学和代谢组学，以及实验验证。这篇观点文章旨在讨论这一领域的最新发展，强调单细胞暴露组学深化我们对细胞对化学暴露及其对人类健康影响的理解的潜力。

图文介绍

空间单细胞暴露组学

空间质谱与单细胞分析的交汇开辟了暴露组学内的新路径，催生了空间单细胞暴露组学这一新兴领域。这一尖端领域利用空间解析质谱的能力，探索单个细胞如何响应并适应其环境暴露。借助高分辨率和空间质谱的双重进步，我们可以构建单个细胞内环境暴露的详细分布图。这种方法不仅揭示了特定化合物的存在，还揭示了它们在细胞或组织内的位置，提供了关于它们如何与细胞组分相互作用并塑造细胞功能的见解。空间单细胞暴露组学通过检测环境污染物及其生物转化产物，并绘制其在细胞内的分布模式，提供了宝贵的信息。在单细胞水平上，空间组织与生物功能之间的联系至关重要。细胞功能与空间背景密切相关 - 分子的位置可以显著影响它们的作用和相互作用。因此，在单细胞暴露组学中，识别分子的空间分布可以揭示细胞对环境刺激的反应的复杂机制。例如，环境污染物进入细胞可能会破坏蛋白质和脂质的空间组织。这可能会改变关键的细胞过程，导致表型变化，如改变的细胞行为或对信号的反应发生改变。在严重情况下，这甚至可能导致细胞走向疾病状态。因此，空间单细胞暴露组学为我们提供了关于细胞对环境污染物的反应的关键见解，有助于我们理解疾病的发病和进展。然而，尽管基于质谱的单细胞暴露组学可以描述异源物的空间分布，但如何细胞与其环境相互作用并适应其环境的全面理解需要综合多组学方法。例如，理解宿主对环境暴露的反应最理想的方法是结合单细胞暴露组学和单细胞代谢组学的数据。一个典型的通过矩阵辅助激光解吸/电离结合质谱的空间单细胞暴露组学工作流首先开始于冷冻切片，这是一种用于空间分析的生物样品制备薄冻切片的技术。一旦准备好冷冻切片，就会施加矩阵溶液。此矩阵有助于样品中的化合物的解吸和电离，以进行后续的质谱分析。然后，准备好的样品经过空间质谱进行数据采集，测量样品中离子的质荷比。通常，矩阵辅助激光解吸/电离和诸如纳米级次级离子质谱的高级方法可以实现单个细胞和组织切片内的详细映射。这些技术可以检测到广谱的化学物质，高分辨率质谱仪器能够在一次运行中识别众多分子，覆盖多种化学类别。同时现代质谱技术的灵敏度允许在宽的浓度范围内检测各种化合物。因此，这些技术使得可以在单个细胞内观察异源物的空间分布，提供了关于细胞内分子组成和组织的见解。最后，使用专门的软件或生信流程处理可视化质谱数据（图1）。这种可视化可以采取热图或其他图形表示的形式，提供样品中存在的异源物的空间解析视图。这一数据可视化步骤允许研究者研究环境暴露与细胞反应之间的错综复杂的相互作用。

图 1. 描述空间单细胞暴露组分析流程的示意图。

单细胞类型暴露组学

与其他组学技术一样，暴露组学领域传统上面临一个关键的挑战：在细胞水平上缺乏分辨率。考虑到不仅在不同的细胞类型之间，而且在单一细胞类型内部都存在的异质性，这一问题变得尤为突出。单细胞类型暴露组学，一个新兴的领域，即将填补这一空白，使研究者能够探索不同细胞类型如何响应相同的环境暴露。利用这种方法，我们可以研究不同细胞类型遭遇的环境暴露范围，并理解它们对细胞功能和健康结果的影响。这种新颖的视角可能会开创精准环境健康的新时代，促进高度针对性的干预和预防策略的发展。单细胞类型暴露组学的原理强调，细胞对环境暴露的反应远非一致。它提供了关于不同细胞类型的差异性易感性和适应策略的独特见解，突显了细胞的应激多样性。对个体细胞类型的关注使研究者能够解码组织内的错综复杂的复杂性和多样性，催生了个性化、针对特定细胞的预防方法的出现。这种针对细胞类型的暴露组学可以揭示为什么某些细胞可能对特定的环境应激因子更为脆弱。例如，特定的神经元可能表现出对某些神经毒素的增加的易感性，这一现象归因于它们所具有的独特基因表达。这种增加的易感性往往根植于它们所表达的独特受体集，某些神经毒素对这些特定受体有更高的亲和力。同时，这些神经元的不同代谢特征，包括能量生产、蛋白质合成和解毒途径，可以进一步增加它们的敏感性。因此，单细胞类型暴露组学在揭示疾病发病机制和进展的细胞特异性机制中起到了关键作用，这在整块组织分析中可能被掩盖。尽管单细胞类型暴露组学具有巨大的潜力，但它也带来了自己的技术挑战。一个重要的问题是在使用高分辨率质谱时的化学注释障碍，这在传统暴露组学研究中就是一个常见的挑战。同时，准确地识别和定量单个细胞中的大量环境化学物是一项艰巨的任务，因为暴露组学的复杂性和多样性。目前在暴露组数据库完整性和色质谱库方面的限制也增加了精确化学注释的难度。这一方面需要进一步的发展和改进，以实现单细胞暴露组学中更准确和全面的化学注释和识别。其他考虑因素包括先选择细胞类型进行分析可能带来的潜在局限性，这可能会限制发现具有不同暴露或代谢物分布的新细胞类型。因此，首先在具有未知数量细胞类型的组织上进行单细胞实验，然后进行数据分析以识别细胞类型可能更有益。荧光活化细胞分选和激光捕获显微切割等先进技术的发展，现在已经使这种精准分离成为可能。结合微流控技术和基于液滴的平台的突破，单细胞隔离已经变得更加高效和微创。在基于单细胞实验数据的细胞隔离和类型识别之后，可以使用高分辨率质谱进行单细胞暴露组学，类似于组织分析。为了在细胞水平提供信息，可以使用如Orbitrap和ToF等高分辨率质谱，因为它们具有广泛的化学检测能力和灵敏度。这些先进的质谱仪可以识别各种化学物质，显示广泛的检测能力。这种工作流程增强了富集或纯化特定样品类型的可能性，揭示了每种细胞类型对不同环境暴露的独特反应，最终促进了在暴露组学领域内细胞反应的更详细和全面的理解。单细胞类型暴露组学的典型工作流程从选择生物样品开始，这些样品可以根据特定的研究问题和目标从人类被测者或模型生物中获得。选择适当的生物样品后，下一步是淬灭，这涉及向生物系统引入特定的溶液，迅速停止所有酶的活性，保持异源物质的当前状态。这一过程确保了在采样时系统的准确状态。淬灭后，样品保持在低温下以防止任何变化。接下来的过程转移到细胞分选或其他类型的分离挑选。这一步对于从样品中分离出所需的细胞类型至关重要，从而实现更准确的分析。鉴于淬灭步骤，生物转化化学品在细胞分选过程中应保持不活跃。然而，需要考虑的是，某些细胞隔离技术可能会破坏细胞的天然状态，影响单细胞暴露组学实验的准确性。因此，采用允许较少侵入性和更高效的细胞隔离的技术非常关键，尽可能保持细胞的天然状态。细胞隔离后，异源物质将被从细胞中提取。可以使用不同的方法进行提取，具体取决于异源物质的性质和细胞类型。然后通过各种色谱与高分辨率质谱分析提取的异源物质。色谱基于它们的物理化学性质分离异源物质混合物后，高分辨率质谱提供了异源物质的质荷比的准确测量，使得可以对样品中存在的化合物进行注释/识别（图2）。质谱得到的复杂数据将使用先进的生物信息学工具和统计方法进行处理和解释。目的是揭示不同细胞类型对异源物质的暴露以及它们的反应机制和潜在的健康影响。

图 2. 描述整体及单一细胞类型暴露组分析流程的示意图。

深化与分子和细胞生物学的融合

暴露组学超越了环境暴露的领域，融合了这些暴露在单细胞水平上的生物响应，从而与健康结果相联系。因此，单细胞暴露组学需要对分子和细胞生物学有深入的了解，因为它基于这些领域的原理。这种专门的方法解密了环境因素与细胞组分之间的复杂相互作用，如DNA、RNA、蛋白质和代谢物，这些组分构成了细胞对环境暴露的响应基础。因此，与分子和细胞生物学的亲密关系不仅对单细胞暴露组学的成功实施至关重要，而且对其数据的重要解释也至关重要。这些领域为暴露组数据提供了必要的生物背景，促进了对环境因素如何影响细胞功能和健康的全面理解。此外，单细胞暴露组学与如单细胞DNA测序、单细胞RNA测序和单细胞代谢组学等其他单细胞技术具有潜在的互助关系。这些技术提供了关于细胞状态的额外信息层，揭示了暴露组是如何转化为细胞功能和健康的。细胞过程的复杂相互作用决定了细胞对环境暴露的响应，无论这些响应是适应的、保护性的、还是不适应的。例如，不同的环境毒素对细胞的影响可能受到细胞解毒机制的调节，如细胞色素P450酶，这些酶受到基因表达、信号传导途径和其他细胞机制的调控。因此，深入了解这些细胞过程对解释单细胞暴露组学的结果至关重要。分子生物学在暴露组学中也起到了关键的作用，提供了如次代测序和CRISPR-Cas9基因编辑等工具，可以阐明观察到的细胞对环境暴露的反应的分子基础。研究者可以利用这些工具来研究特定环境应激反应下的基因表达变化或DNA甲基化的变化。通过这样做，他们可以开始揭示细胞适应和疾病发展的潜在触发因素所涉及的复杂分子途径。结合单细胞RNA测序和单细胞暴露组学可以帮助将特定的环境暴露与基因表达的变化相联系，揭示细胞对环境的反应的分子机制。同样，单细胞代谢组学可以通过提供对环境暴露反应的代谢和生物转化通路变化的洞察来补充单细胞暴露组学。这种融合可以导致单细胞水平的多组学方法，为对环境暴露的细胞响应提供更全面的视角。作为一种组学方法，单细胞暴露组学产生了关于单个细胞所经历的环境暴露的广泛和详细的数据。然而，为了验证由丰富数据生成的假设，关键是要结合分子和细胞生物学的机理验证。这是因为暴露组数据，虽然全面，但往往需要验证和背景来理解观察到的现象的生物学意义。分子和细胞生物学方法可以提供这种背景，提供机械洞察如何具体暴露可能影响细胞功能和行为。例如，当暴露组数据建议特定的异源物可能影响细胞过程后，体外和体内的实验研究可以阐明涉及的确切分子途径，受影响的特定细胞组分，以及对细胞功能的更广泛含义。因此，分子和细胞生物学方法在单细胞暴露组学产生的假设的解释、验证和适用性中起到了不可或缺的作用（图3）。然而，这种融合需要应用复杂的生物信息学工具进行多组学数据的整合、解释和可视化。因此，与生物信息学和计算生物学的紧密结盟对单细胞暴露组学至关重要，有助于充分利用生成的数据。

图 3. 结合单细胞暴露组学与分子和细胞生物学方法，以验证和解释环境及生物医学的含义。

总结与展望

该论文发表在Environmental Science & Technology上，匹兹堡大学高鹏助理教授为本文的通讯作者。本文为其第二次在Environmental Science & Technology发表单独作者的观点文章，上篇文章发表于2021年：10.1021/acs.est.0c07033。

作者简介：

高鹏 教授

高鹏博士是一名分析化学家和暴露科学家，并在环境和生物医学学科都接受过全面的培训。在获得佛罗里达大学的博士学位后，他开始在斯坦福大学医学院从事人类暴露组项目，担任博士后学者。目前，他在匹兹堡大学公共卫生学院的环境和职业健康系任助理教授。此外，他还在土木和环境工程系有二级职位，并是匹兹堡大学医学中心希尔曼癌症中心的正式成员。高博士的研究集中在跨学科领域，包括环境化学、分析化学、分子流行病学、毒理学和宏基因组学，旨在将暴露组学与多组学信息结合起来，探讨暴露组对人类健康的影响，并了解慢性和特发性疾病的根本原因。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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