ACS Chem. Biol. | 化学蛋白质组学揭示抗生素扰乱金属蛋白稳态的机制

英文原题：Chemoproteomics Reveals Disruption of Metal Homeostasis and Metalloproteins by the Antibiotic Holomycin

供稿人：杨振霖 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology的文章“ Chemoproteomics Reveals Disruption of Metal Homeostasis and Metalloproteins by the Antibiotic Holomycin ” 这篇文章来自于北卡教堂山分校的Bo Li教授课题组，在这篇文章中，作者使用了二甲基化定量以及半胱氨酸组学分析的手段，研究了全霉素（holomysin）在细菌体内与金属蛋白的作用，并且确定了全霉素关键结合的一些金属蛋白质，为抗生素在细菌内如何打破金属蛋白稳态机制提供了可靠的数据支撑。

能够和金属结合的小分子一直以来就是可靠的金属酶的抑制剂，尽管目前已经有很多金属酶的抑制剂，但是这些分子是如何影响细菌中金属蛋白质组的目前还没有明确定论，基于此，作者以holomysin（全霉素）为研究模版，采用了基于活性的蛋白质组分析（ABPP）方法，以大肠杆菌为模型，通过二甲基化的策略鉴定了holomysin在大肠杆菌中结合的一系列高置信度的蛋白。同时，由于半胱氨酸是金属蛋白酶结合口袋的非常关键的能够稳固金属离子的氨基酸残基，如果金属脱离了原来的金属蛋白酶口袋，那么脱离前后与金属相结合的半胱氨酸的反应性将会出现明显的增加，所以作者同时采取了高活性半胱氨酸分析策略，通过半胱氨酸的反应活性，定量的监测holomysin导致的蛋白质组变化。监测半胱氨酸的反应活性有助于识别在人类蛋白质组内的Zn结合的半胱氨酸，并且也有助于阐明在Fe-S簇内的铁原子占据情况，本文的作者第一次将二甲基化蛋白质组丰度分析以及活性半胱氨酸分析结合在一起，并且通过总丰度分析对活性半胱氨酸分析进行校正，最终证明，holomysin会影响锌结合蛋白和铁结合蛋白的缺乏，并激活细菌的应激反应。

下面我们来具体看一看作者的实验第一个阶段，蛋白标记—质谱鉴定阶段，如图1所示，作者通过两种途径鉴定蛋白质组变化，首先，作者分别用DMSO和holomysin对细菌进行了一个小时的处理，处理后对大肠杆菌的细菌裂解物进行蛋白的纯化和胰蛋白酶酶切，酶切后的产物进行轻重标的标记，并最终送入LC-MS/MS中进行鉴定，作者同时采取了第二种isoTOP-ABPP的活性半胱氨酸分析法进行辅助鉴定，采用类似的策略，作者认为被holomysin处理过的活性半胱氨酸含量与对照组有较大不同，基于此，作者分别对细菌进行DMSO和holomysin的处理。处理过后的蛋白质进行了半胱氨酸残基的碘乙酰胺的标记，并利用另一端的炔基弹头进行轻重标标记，富集后酶切，将肽段送入二级质谱中进行鉴定。采用这两种方法，作者得到了一系列数据，并进行了后续的数据分析。

接下来是实验的第二阶段，也就是数据处理与分析阶段，作者这里采用了两种手段相辅相成，互为补充的方法，首先利用二甲基化蛋白质组丰度分析的方法进行了两组生物学的重复。两组生物学重复性非常好，我们可以看到在几种holomysin处理的样品中，几种锌相关蛋白显示出了丰度的增加，包括周质量锌转运蛋白ZnuA，其对Zn的吸收非常重要，轻重标的比例达到了2.42，同时通过转录组的分析，基因ZnuA以及YkgM是大肠杆菌在缺Zn条件下上调最明显的两个基因，基于此，我们可以判定holomysin的处理会导致大肠杆菌出现锌饥饿的现象。同时，全蛋白质组的分析还判定了holomysin会诱导铁的限制，在holomysin的处理中，我们可以看到Fur是丰度降低较大的蛋白，Fur是一种铁调节剂，在铁的稳态与转录调节中发挥着非常关键的作用。同时也可以看到参与Fe-S簇运输的A型载体蛋白ErpA也出现了相应的丰度的降低，对Fe-S簇蛋白运输的缺失会进一步影响大肠杆菌内的金属稳态。基于此，二甲基化分析证明了holomysin会很大程度上影响锌相关蛋白和铁相关蛋白的表达，这与我们的认知相符，并且更加详细的说明了holomysin的作用机制。

对二甲基化进行过分析后，作者紧接着进行了活性半胱氨酸质谱结果的分析，作者同样得到了轻重标的比例数据，为了让这个数据更加可信，作者使用第一种方案的蛋白丰度结果对第二种方案的半胱氨酸活性分析结果进行了校正，校正的结果如图3A所示，我们可以看到校正蛋白质丰度之后，变化最显著的蛋白质是延胡索酸，丰度校正后的isoTOP-ABPP的比率是5.66，FumA是三羧酸循环中的含有[4Fe-4S]簇的代谢酶，质谱确定了Cys的105号位是修饰的残基，Cys105号位置参与Fe-S簇的结合，基于此，作者接下来针对于FumA做了功能的验证，从图3(B)中我们可以看出，从正常培养基中纯化出来的FumA可以将苹果酸迅速的转化为富马酸，但是从添加holomysin培养基中纯化出来的FumA却几乎没有任何活性。这也就证明了FumA确实是受holomysin影响较大的蛋白质，证明了作者的质谱方法的正确性。接下来，作者同样对于Can（碳酸酐酶II），YahK，MetE等酶进行了阐述，证明了其质谱方法的广谱性。

总的来说，这篇文章使用了二甲基化蛋白质丰度分析的方法结合活性半胱氨酸分析的方法，对holomysin处理前后的细菌内蛋白质组变化进行了分析，并且确定了几种锌结合酶，铁结合酶作为潜在的靶标，作者的蛋白质组分析发现，holomysin会导致细菌出现锌和铁的饥饿，进而导致细菌的应激反应。为这一类型抗生素的在细菌中如何结合金属蛋白，打破细菌金属蛋白稳态环境提供了充足的数据支撑和独到的见解。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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