Hortic Res | 西北农林科技大学在中国野生毛葡萄丹凤-2新芪合酶基因VqNSTS3抗白粉病及其调控机理研究中取得新进展

葡萄是跨越世界南北最重要的栽培果树之一，果实可用于酿酒、鲜食、制汁及制干等，创造了明显的经济效益。但是葡萄病害，尤其是白粉病是严重危胁葡萄生产的真菌病害，病害发生与流行时，常常造成产量损失、品质降低与巨大经济损失。因此，研究葡萄抗病种质资源与抗病基因是解决葡萄抗病性问题有效途径。在葡萄上，研究认为白藜芦醇是葡萄植物体内一种特有植保素，白藜芦醇在葡萄中增强植株的抗病性，白藜芦醇是芪合酶基因表达的具有抗病作用的植保素，研究者早期在欧洲葡萄品种中获得了表达白藜芦醇的芪合成酶基因，并对多种植物转芪合成酶基因以增强植株的抗病性。

中国是葡萄属植物重要的起源中心之一，蕴藏着丰富的野生葡萄种质资源。40多年来，我们在对中国野生葡萄种质资源收集与保存，研究与评价利用过程中，发现中国野生葡萄没有美洲葡萄的草莓味且易于欧洲葡萄品种杂交获得杂种后代，特别是对中国野生毛葡萄丹凤-2这个抗病性强而且白藜芦醇含量高的类型与欧洲葡萄品种赤霞珠进行转录组测序时，发现了丹凤-2拥有新的转录本，那么新的转录本是不是芪合酶基因家族新成员，如果是新成员，其功能表达及其增强抗病性的机理是什么？弄清楚新基因及其表达机理，利用中国野生葡萄新基因，为葡萄抗病育种与增强抗病性提供了科学依据基因资源。

2023年7月，Horticulture Research 在线发表了西北农林科技大学题为VqMAPK3/VqMAPK6, VqWRKY33,and VqNSTS3 constitute a regulatory node  in enhancing  resistance to powdery mildew in grapevine的研究论文。

本研究的主要科学问题是新的转录本是不是中国野生葡萄的芪合酶基因家族的新成员？如果是新成员，这个新基因的功能与表达机理是什么？

本研究通过分析丹凤-2的转录组数据鉴定到了6个新的芪合酶基因转录本，对其中编号第3的转录本通过同源克隆的方法克隆获得了VqNSTS3 ，通过分析其序列，基因长1179bp，编码393个氨基酸；比对VqNSTS3 基因结构，携带芪合酶家族的保守结构域IPNSAGAIAGN保守序列，表明VqNSTS3 具有芪合酶基因家族的保守结构域和序列特征。采用qRT-PCR分析VqNSTS3 在白粉菌处理后，发现VqNSTS3 的转录水平在接种白粉菌后上调表达；将克隆获得的VqNSTS3 瞬时转入没有芪合酶基因的烟草植株中，3天后检测到了反式白藜芦醇与反式云杉新苷，根据序列特证与在烟草里表达的产物，证明中国野生毛葡萄丹凤-2芪合酶家族的新成员VqNSTS3 是新的芪合酶基因。利用农杆菌介导的方法将VqNSTS3 转入欧洲葡萄品种‘无核白’中，获得转基因植株。转VqNSTS3 无核白过表达葡萄植株，在接菌后不仅促进了芪类物质积累，而且诱导了水杨酸途径相关基因PR1 和PR5 以及抗性相关RBOHD 和CHIT4C 基因的表达。另一方面，对丹凤-2叶片中瞬时干扰VqNSTS3 ，干扰植株表现出对白粉菌易感性的增加。通过酵母单杂交筛选出调控VqNSTS3 基因表达的转录因子VqWRKY33，克隆得到VqNSTS3 的启动子序列，分析其顺式作用元件，发现在VqNSTS3 的启动子序列上有3个WRKY转录因子结合的顺式作用元件W-box。通过酵母单杂交，双荧光素酶和CHIP-qPCR试验研究，VqWRKY33转录因子通过直接结合VqNSTS3 启动子上的TTGACC元件，正向调控VqNSTS3 基因的表达，从而促进芪类物质表达与积累，转基因VqWRKY33 ‘无核白’植株，在接种白粉病菌后，表现出增强了对白粉病的抗性。发现了葡萄蛋白激酶VqMAPK3和VqMAPK6磷酸化转录因子，调控VqNSTS3 的表达，形成抗病级联信号传导，增强芪类物质的积累和抗病性。

研究发现，在白粉病菌侵染过程中，中国野生毛葡萄丹凤-2体内构成VqMAPK3/VqMAPK6，VqWRKY33，和VqNSTS3一个调控节点，增加体内芪类物质表达与积累，增强葡萄植株抗白粉病能力。

本研究的创新点是利用蘸花法将VqNSTS3 转入模式植物拟南芥中，通过共聚焦显微镜观察到VqNSTS3 在病原菌侵染时，VqNSTS3 被微小囊泡结合，主动向白粉菌孢子的侵染点吸器处移动，包裹病原菌吸器周围，形成抗病屏障阻挡白粉菌的侵入。

图1 在转基因VqNSTS3 拟南芥接种白粉菌侵入过程中，表达的VqNSTS3 被微小囊泡结合，主动移向白粉菌孢子的侵染点吸器处，包裹在病原菌吸器周围，形成抗病屏障阻挡白粉菌的侵入。

图2 中国野生毛葡萄丹凤-2在白粉病菌侵染过程中形成VqMAPK3/6-VqWRKY33-VqNSTS3的三级级联信号增加了芪类物质表达积累并增强了植株的抗病性

西北农林科技大学园艺学院在读博士生刘婉迪和已毕业博士生闫朝辉为本文共同第一作者。西北农林科技大学园艺学院徐炎教授和王跃进教授为论文共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金项目（32272667）资助。

文章链接：

‍https://doi.org/10.1093/hr/uhad116

转自：“园艺研究”微信公众号

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