GB | 华中农大张献龙教授团队利用单细胞测序技术揭示棉花优良转化受体-Jin668强体细胞胚胎发生能力的分子机制

植物体细胞再生问题一直以来备受关注。高等植物的体细胞再生方式主要有器官发生和体细胞胚胎发生。目前，通过农杆菌介导遗传转化并体细胞胚胎发生或器官再生是获得转基因植物的主要方式。愈伤组织的形成是植物进行体细胞胚胎发生的关键步骤，前人的研究表明该过程受到许多因素影响：包括植物组织的机械损伤信号转导和激素响应与信号激活。然而，关于体细胞胚胎是来源于外植体组织中的单个细胞还是多个细胞以及控制细胞重编程以启动胚胎发育的机制仍然知之甚少。

棉花是典型的通过体细胞胚胎发生途径实现植株再生的作物，是研究体细胞胚胎发生过程的经典模型。棉花的体细胞培养、植株再生过程非常耗时且是高度基因型依赖的，目前只有少数棉花品种（基因型）能够通过组织培养获得体细胞再生植株。转化受体材料、再生效率低、周期长的缺乏，严重制约了棉花的分子生物学研究及分子育种的快速发展。如何提高棉花的体细胞再生效率、打破基因型依赖性是亟待解决的问题。Jin668是本团队近年来选育的优良遗传转化受体材料，该材料是以农艺性状较好的棉花主栽品种为研究对象，经过连续再生驯化（SRA）策略（通过获取经过体细胞胚胎发生过程获得的再生植株的种子，作为下一次组织培养的受体材料，连续重复这一过程多次）培育的转化效率高、综合农艺性状优良的遗传转化受体材料（Li et al., 2019, Plant Biotechnology Journal）， 目前全球超过60多家棉花科研单位利用该材料成功进行了5000多个基因的遗传转化和基因编辑研究，是目前国际上应用最广泛的棉花转化受体材料，该项成果得到国际棉花基因组协会（ICGI）/美国棉花公司（Cotton Incorporated）的高度认可，于2021年授予本团队棉花生物技术奖-Cotton Biotechnology Award。然而，Jin668的高转化效率和高再生能力背后的基因调控机制仍然未知。之前的研究发现不同的细胞类型，可重编程能力不同。因此，在单细胞水平上准确分析体细胞重编程的过程，对于提高我们对植物再生调控机制的解析，挖掘决定植物再生能力的关键“密码”，为未来打破棉花再生的基因型限制，具有重要的理论和实践价值。近日，华中农业大学张献龙教授领衔的棉花团队在Genome Biology杂志上发表了题为“Single-cell resolution analysis reveals the preparation for reprogramming the fate of the plant stem cell niche in lateral meristems”的研究论文，该文用Jin668和不可再生材料TM-1为实验对象，结合单细胞测序技术在单细胞层面解析棉花的体细胞胚胎发生机制。通过对不同再生能力材料的对比，挖掘到决定体细胞胚胎发生能力的关键基因并构建了棉花体细胞胚胎发生的基因调控网络。

在农杆菌介导的以棉花下胚轴为外植体的转化过程中，农杆菌主要侵染初生维管组织（图1）。体细胞经过脱分化形成愈伤组织是体细胞胚胎发生的关键步骤，棉花下胚轴对于激素诱导的响应十分迅速，在诱导3天后下胚轴两端膨大，诱导7天后部分细胞已经完成脱分化产生愈伤组织。因此，我们选取在培养基上诱导0，1，6，12h的Jin668和TM-1的下胚轴进行单细胞取样，根据marker基因的表达情况最终确定了7种主要的细胞类型（图2）。

图1 GFP和RFP报告基因在棉花下胚轴初生维管组织表达

图2 棉花转化受体-下胚轴细胞类型鉴定

Jin668和TM-的细胞类型具有高度的一致性，我们发现与生长素、细胞分裂素和伤口诱导相关的基因在初生维管组织细胞类型，包括初生木质部，薄壁组织和形成层细胞中表达。因此我们推测，分化程度较低的细胞类型对激素的诱导更加敏感，是愈伤组织形成的主要细胞类型。为了进一步了解细胞命运向胚胎命运转变背后的分子机制，对这两个品种的相同细胞类型的基因表达情况进行了进一步的分析。首先，在初生木质部、形成层和薄壁细胞中鉴定到许多和再生相关的差异基因（DEGs），这些差异基因在Jin668和TM-1中有不同的表达模式。很多体细胞胚胎发生相关的基因在可再生材料Jin668中上调表达，而在TＭ１中下调表达。其中，维持生长素极性分布的基因以及生长素内流相关基因AUX/LAX在Jin668的形成层和薄壁组织细胞中特异表达，而一些生长素外流的基因在这些细胞类型中下调表达，这表明生长素的分布和极性转运对于细胞的脱分化和再分化有重要作用（图3）。

图 3 Jin668和TM-1相同细胞类型中的差异表达基因

拟时序分析结果发现，Jin668和TM-1的细胞有不同的生长素分布模式，和TM-1相比，Jin668初生木质部细胞有明显的生长素极性建立，更容易脱分化形成愈伤组织。同样的，RNA速率结果表明，TM-1的初生木质部细胞更倾向于分化为根细胞类型而不是形成愈伤组织。综合以上结果表明，在棉花下胚轴体细胞胚胎发生过程中，初生维管组织细胞是形成愈伤组织的主要细胞类型，生长素是影响细胞去分化的主要因素，生长素的极性转运决定了细胞获得胚胎的能力。此外，不同细胞类型之间的细胞通讯也影响细胞的去分化。在这个过程中，一些决定性的基因影响愈伤组织的诱导和体细胞胚胎的形成。最后，通过敲除和过表达实验验证了生长素转运相关基因LAX2影响愈伤组织诱导并能提高胚性愈伤的形成。

目前，我们正在对这些与体细胞胚胎发生相关的关键基因（“再生因子”）进行深入的功能解析（图4），更全面地研究体细胞胚胎产生背后的机制，以期将这些“再生因子”导入到不能再生或再生能力较弱的基因型中，实现高效的体细胞再生，从而彻底打破棉花体细胞植株再生的基因型依赖，实现更多的棉花品种的植株再生，为棉花功能基因组研究和分子育种实践奠定重要的技术平台。

图 4 棉花体细胞胚胎发生分子调控网络

本论文得到国家自然科学基金、湖北洪山实验室重点项目资助。博士生朱相潜和博士后许忠平为论文共同第一作者，张献龙教授和金双侠教授为论文的共同通讯作者，英国杜伦大学的Keith Lindsey 教授、杨细燕教授、涂礼莉教授，袁道军副教授、李波研究员等参与了本项研究。

原文链接：

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-023-03032-6

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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