目前发现的最有趣的一类生物材料是聚羟基烷酸酯(PHA)家族的微生物生物聚合物，由于单体单位组成的特殊性赋予了它们独特的性质。相芳烃是一类通过生物聚合过程产生的聚酯，在营养限制的条件下被一些微生物积累作为碳储存和能量储备。在有利的生长条件恢复后，微生物对PHA的细胞内或细胞外消耗提供了它们在许多环境中的自然生物降解性。广泛的单体可以被纳入PHA，它们通常由短链(3-5个碳单元)和/或中链长度(6-14个碳单元)单体组成。通过发酵在工程细菌中生产的用于商业目的的聚合物包括聚[(R)-3-羟基丁酸盐](PHB)和聚(4-羟基丁酸盐)(P4HB)，共聚物聚[(R)-3-羟基丁酸盐-co-(R)-3-羟基戊酸盐](PHB- 4hb)，聚[(R)-3-羟基丁酸盐-co-(R)-3-羟基己酸盐](PHBV)和聚[(R)-3-羟基丁酸盐-co-(R)-3-羟基己酸盐]。
PHA是一类可生物降解的聚酯，在许多应用中可以取代传统塑料，在所有生物活性环境中都能完全降解。改变PHA的单体组成可以产生具有一系列性能的材料，从而可以获得许多石油衍生塑料的合适替代品。除塑料生产外，PHA还可用于医疗，通过热分解转化为商品化学品的小分子前体，并用于废水处理。目前细菌发酵生产的PHA已成功进入高价值医疗应用市场，但发酵的高资本和运营成本迄今阻碍了它们在商品应用中的广泛应用。尽管生物可降解性带来了一定的环境效益，但成本仍然是限制新产品研发的关键因素。以植物为基础的聚羟基烷酸酯(PHA)和种子油的联合生产有可能为可再生燃料和塑料创造一个可行的原料来源。
近日，国际著名期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Polyhydroxybutyrate synthesis in Camelina: Towards coproduction of renewable feedstocks for bioplastics and fuels”的文章。本文报道了利用细菌PHB生物合成途径在亚麻荠种子细胞质中产生PHA聚[(R)-3-羟基丁酸](PHB)。在该文章中，作者采用了两种方法:将PHB途径的所有三种酶在种子中定位于细胞质中，或将途径的前两种酶定位于细胞质中，并将聚合所需的第三种酶锚定在内质网(ER)的细胞质表面。研究发现，以ER为目标的方法可以提供更稳定的聚合物产量，PHB水平可达成熟种子质量的10.2%，植株具有良好的生存能力。这些结果标志着PHB的大规模生产向商用化迈出了重要的一步。基于植物的PHA生产将使生物可降解聚合物和种子油的低成本大规模农业生产与全球塑料和可再生燃料市场之间建立直接联系。
目前在叶片叶绿体中产生PHB已经进行了大量的研究，如通过共表达编码质体靶向β-酮硫酶(PhaA)、NADPH依赖性还原酶(Phaβ)和PHA合成酶(PhaC)的基因，将质体乙酰辅酶A转化为聚合物。PHB在叶绿体中已经实现了高水平的生产，在拟南芥中PHB可达到干细胞重量的~40%，但当产生显著水平(>3%干细胞重)时，通常会导致植物表型发育不良。尽管存在挑战，但在油籽中生产PHA可能是有利的，因为它简化了加工前收获产品的物流和储存，并可同时获得籽油和富含蛋白质的膳食。
在该研究中，作者选择在种子细胞质中研究PHB的生产，探索在胞质溶胶中是否会产生高水平PHB和出苗良好的种子。作者选择种子高含油量的十字花科亚麻荠C. sativa作为研究对象，除了在种子的胞质溶胶中表达PHB生物合成途径之外，在研究中的一个关键要素是用C-末端序列修饰PHB生物合成途径的最后一个酶PHA合酶(PhaC ),该序列以前已被证明能将重组蛋白尾锚定到PHB的末端内质网的胞质面。
亚麻荠种子特异性细胞质中PHB的产生
由于丙二酰辅酶A是由乙酰辅酶A衍生而来，因此靶向PHB生物合成途径到细胞质可以捕获和转化一部分指定用于脂肪酸延伸到聚合物的碳（图1）。作者使用农杆菌介导的植物转化系统将遗传构建体pMBXS394（用于检测种子中PHB的细胞质生成）转化。通过DsRed可视化技术鉴定了被推测转化系的第一代(T1)种子，从分离的种子群体中挑选出DsRed阳性的T2种子样本，使用气相色谱(GC)测定PHB含量。分析的63个T1系中56个株系的T2种子产生了可检测的PHB水平。获得的最高PHB水平为成熟种子重量的4.5%(图2a)，这一水平明显高于以前在植物细胞质中达到的PHB最高水平(棉纤维中DW含量为0.34%)。将PHB含量≥2%(成熟种子重量)的T2种子在土壤中萌发，并测定各品系的出苗和成活率(图2b)。研究发现，两种聚合物产量最高的pMBXS394株系(成熟种子PHB为4.5%和4.2%)的存活率分别为33%和93%。PHB生产系子叶海绵状叶肉和栅栏状叶肉的细胞间隙明显减少，甚至没有间隙。与WT43对照相比，不同品系产生PHB的种子的幼苗发育延迟了1-5天。
将PHA合成酶靶向内质网策略
为了将聚合物水平提高到超过转化构建体pMBXS394获得的4.5% PHB，作者开发了一个遗传构建体(pMBXS763)，其中PHA合成酶(PhaC)在其C端融合到拟南芥细胞色素B5异构体D蛋白的序列，该序列先前已被证明可以将重组蛋白锚定在内质网的细胞质表面。在分析的77个T1系中，74个种子中产生了可检测水平的PHB。部分产PHB >4%的系成活率较好(图2c,d)。与pMBXS394转化系一样，pMBXS763 T2幼苗的子叶比WT43的子叶窄(图3c)。光镜下pMBXS763子叶细胞结构与pMBXS394子叶细胞结构相似(图4、h)， TEM分析证实子叶液泡和细胞质中存在PHB(图5、F)。
图3 用pMBXS394和pMBXS763转化WT43对照和T2幼苗的表型种子在土壤中发芽，幼苗在子叶完全展开阶段，第一片真叶出现时拍摄
PHB颗粒、油脂和蛋白体在种子中的空间分布
利用透射电镜(TEM)分析了子叶区pMBXS394、pMBXS763和对照WT43种子的超薄切片，研究了PHB、油体和蛋白体的空间分布。在pMBXS394和pMBXS763的T2种子中，观察到PHB颗粒散布在细胞质中(图4k, 1, 0,p)，但在对照WT43种子中没有PHB颗粒(图4i,j,m,n)。在WT43中可以看到位于含有蛋白体的蛋白质储存液泡周围的有序油体结构，而pMBXS763系12-0933的T2种子中含有4.9% PHB的油体明显少于对照(图4)。
图4 用pMBXS394和pMBXS763分别转化WT43和WT43的T2幼苗子叶和种子的显微观察
T4种子产生的聚合物的表征
从pMBXS763纯合子T3系收获的种子中分离得到聚合物，并用凝胶渗透色谱和1H NMR对其进行表征，证实该材料为高分子量PHB。1H NMR实验中，温室种子和室内种子的聚合物含量最高(成熟种子重分别为7.1%和10.2%)，提取的聚合物被确认为PHB。采用氯仿和凝胶渗透色谱法测量分子量。重量平均分子量(Mw)从80万到略低于180万，聚合物分子量与种子聚合物含量成反比。最后，作者还选择pMBXS763系的T4种子样品，在标准温室或受控环境条件下生长，检测油和蛋白质含量，以确定细胞质中PHB的产生是否影响这些种子储存产品的数量。在受控环境室内生长的植物始终比在温室中生长的植物产生更多的油。在PHB产生的温室植物中，油的脂肪酸谱也发生了显著变化，16:0、18:0、18:3、20:3和22:0的脂肪酸谱增加，18:2和20:2的脂肪酸谱减少。在室内生长的植物中，PHB产量在16:0、18:3和20:3时显著增加，在18:1、18:2、20:1和20:2时显著减少。种子蛋白质水平与PHB产量基本保持不变，室内和温室植物收获的种子蛋白质含量相似。
总之，PHA是世界塑料问题的主要解决方案，它们是可再生的、可生物降解的材料，在许多应用中可以取代石油基塑料。但大规模细菌发酵生产的PHA的广泛使用受到生产的高资本和运营成本的阻碍。以植物为基础的PHA生产可以显著降低生产成本。当生物合成途径在植物中表达时，植物中PHA的产生通常会导致负面的农艺效应，包括当途径在营养组织中表达时植物生长受损或通过种子特异性表达降低幼苗存活率。油籽(如Camelina sativa)是PHB及其共聚物生物合成的理想选择，因为乙酰辅酶A是PHB和种子油生物合成的共同底物(图1)。在这项研究中，作者首先评估了细胞质作为PHB种子特异性生产位点的替代选择。使用强种子特异性启动子(转化构建物pMBXS394)在T2种子中产生PHB, PHB水平高达成熟种子重量的4.5%。接下来，作者采用了一种将PHA合成酶锚定在内质网细胞质表面的策略，试图稳定PHA合成酶，从而稳定聚合物的生产。在T2种子中产生的PHB高达成熟种子重量的4.9%。重要的是，这些品系在多代中显示出稳定的PHB产量，其中一些品系在温室纯合子T4种子中显示出聚合物水平增加，PHB产量增加7.1%。该研究结果表明，在转化构建体pMBXS763中，融合了内质网靶向信号的PhaC比不含内质网靶向信号的含有PhaC的转化构建体pMBXS394更稳定地合成了PHB，经过多代后，PHB的产生更加稳定。使用受控环境室模拟春季生长条件可产生更高水平的PHB，在T4种子中观察到高达10.2%的PHB, T3幼苗出苗和成活良好(78%)。产生ER靶向PHB的幼苗绿色健康，但具有比野生型对照更窄的子叶(图3)。
综上，作者证明在亚麻荠种子中产生高达10.2%的PHB，并具有良好的幼苗活力。这是为准备商业化生产迈出的重要一步。该研究是关于PHB在种子细胞质中产生的第一篇报道，并且是迄今为止植物细胞质中PHB产生的最高水平，是以前报道的细胞质中PHA最高产量的30倍！
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.14162
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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