PBJ | 云南烟草研究院利用长片段精准基因敲入技术获得具有TMV抗性的烟草植株

近日，云南省烟草农业科学研究院利用原生质体技术结合CRISPR/Cas9基因编辑，成功在烟草中实现了长基因片段的无缝敲入，快速获得了具有TMV抗性的植株，拓展了植物基因编辑技术的应用。相关研究论文“CRISPR/Cas9-mediated seamless gene replacement in protoplasts expands the resistance spectrum to TMV-U1 strain in regenerated Nicotiana tabacum”，已于近日在国际植物学权威期刊《Plant Biotechnology Journal》(影响因子13.8)在线发表。

CRISPR/Cas9基因编辑系统被认为是生物学中的革命性技术，由于其易于操作、精确编辑的特点在植物基因组突变和作物精准育种上广泛应用。但目前在抗病毒育种中应用的植物基因编辑技术主要集中于基因敲除，缺少有效的基因敲入的技术体系，限制了其应用。针对这一局限，本研究课题组首先开发了原生质体介导的基因编辑体系，在烟草原生质体中实现了GFP报告基因的完整敲入及表达。之后通过优化原生质体转染、培养及再生等一系列环节，成功提高了原生质体再生植株的效率，进而建立了完整的原生质体基因编辑并获得对应基因编辑植株的体系（图1），该体系具有高转化效率、避免嵌合体以及无转基因成分的优势。

图1. 原生质体介导的基因敲入体系的建立及优化

野生物种中包含很多优秀的基因资源，来自野生花烟草中的N’alata基因具有针对普通花叶病病原TMV-U1株系的抗性。普通烟草中的N’同源基因与N’alata基因具有97.7%的序列一致性，但却不具备针对 TMV-U1 株系的抗性。课题组根据N’alata和N’基因的氨基酸序列差异通过将两个基因之间进行重组并验证重组基因的抗性，发现N’alata中第265-798个氨基酸以及第1130-1233个氨基酸区段是负责TMV抗性的核心区段（图2）。

图2. N’alata基因抗性核心区域的确定

在此基础上，研究人员利用原生质体介导的基因敲入技术将普通烟草中N’基因的抗性核心区域精准替换为野生烟中N’alata基因的对应区域，获得的基因编辑植株具备了针对TMV-U1的抗性，同时该抗性植株不含有转基因成分（图3）。

图3. 通过两步基因编辑，利用N’alata中抗性核心区段替换了烟草中N’基因的对应区域，使烟草植株获得了针对TMV的抗性

该研究在植物中实现了长基因片段的无缝敲入，直接精准改良了植物的抗性，为植物基因功能验证、野生物种基因资源利用等方面提供了新的技术手段，拓展了植物基因编辑技术的应用范围。

上述工作得到了国家自然科学基金（31860499）及云南省烟草公司重点科技项目等资助，云南省烟草农业科学研究院-华大联合育种研究院、深圳华大生命科学研究院的李燕莉博士、云南省烟草农业科学研究院的黄昌军博士和刘勇博士为该论文共同第一作者，云南省烟草农业科学研究院的袁诚博士为该论文的通讯作者。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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