随着革命性的基因组编辑技术和对生物学特性的不断了解，通过人工设计进行知识驱动的育种已成为现实。知识驱动的育种，可以精确地修改农作物的性状，并可以创造新的性状，甚至是新的农作物，以满足不断增长的人类需求和新的农业模式。以往大家都集中在如何选择基因进行基因编码区的编辑，以期获得突变或碱基替换的突变体，来改变植物的某些性状。然而，基因的启动子上含有多种调控元件，通过基因编辑基因启动子是否可以微调控基因的表达呢？
近两年来，有多项高水平文章研究表明通过基因编辑技术来编辑植物基因的启动子也能达到改善或加强作物农艺性状，又不影响其他性状的效果。我们公众号iPlants现总结其中一些代表作，以供大家学习其中思路！
1. 2021年3月5日，Cell杂志在线发表了来自美国冷泉港实验室Zachary B. Lippman课题组题为“Conserved pleiotropy of an ancient plant homeobox gene uncovered by cis-regulatory dissection”的研究论文。该研究通过高通量CRISPR技术筛选茄科和十字花科植物WOX9 基因启动子区的多个非致死突变体，发现WOX9启动子区存在多段顺式序列元件可调控基因的多效性功能，且这种多效性基因功能在物种间保守。该研究充分说明了启动子区不同位置的顺式序列元件调控不同的功能。
该研究首先利用了ATAC-seq技术，检测番茄分生组织内染色质开放状态，发现在WOX9启动子内主要存在四个染色质开放区。然后利用高通量CRISPR编辑系统在番茄中构建了大量WOX9启动子区等位突变体，以达到能有效操纵基因表达的目的。研究发现突变在四个不同区域，其发育表型不一样，这说明了番茄WOX9基因具有多效性功能，且这种多效性被基因启动子区不同位置的顺式序列元件调控。之后该研究确认WOX9基因的多效性功能在进化中是否保守。该研究首先发现，启动子区段 I和II在茄科植物间具有高度的序列保守性。因此选取茄科物种种地莓，在其WOX9同源基因启动子区段I和II进行高通量CRISPR编辑，发现与番茄的表型相似，说明了WOX9的多功能和调控的顺式元件在茄科植物保守。此外，该研究进一步在十字花科拟南芥中的WOX9启动子区序列发现24个高度保守的短序列，也同样发现WOX9基因的营养生长和生殖生长调控功能在不同科属物种间高度保守。
综上所述，该研究通过高通量CRISPR技术筛选WOX9 基因启动子区多个顺式作用元件，发现WOX9 基因具有功能多效型，并且进一步证实在茄科甚至在十字花科都保守。
论文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00151-3
2. 2021年2月25日，Nature Plants在线发表了来自美国冷泉港实验室David Jackson团队题为“Enhancing grain-yield-related traits by CRISPR–Cas9 promoter editing of maize CLE genes”的研究论文，该论文通过CRISPR–Cas9基因编辑手段微调CLAVATA-WUSCHEL（CLV-WUS）信号通路中的基因启动子可以增加分生组织的大小，并增加了多种与玉米产量相关的性状，为作物改良中的基因组编辑提供了巨大的潜力。
该研究首先利用了ATAC-seq和MNase-seq数据，确定编辑了ZmCLE7和ZmFCP1的启动子区域，以达到能有效操纵基因表达的目的。研究产生了两个基因的多个弱等位基因，其中ZmCLE7和ZmFCP1表达减少，但是能够维持正常的IM结构，而并增加籽粒行数和籽粒产量，而不会破坏其他重要的农艺性状。另一方面，该研究海鉴定了玉米中新的CLE基因ZmCLE1E5，该基因在Zmcle7突变体中表现出补偿性上调。该研究编辑了ZmCLE1E5的编码区，并获得了两个功能缺失的等位基因。研究结果表明, Zmcle1e5的突变表现出正常的IM发育，但是可以定量增强与谷物产量相关的性状，表现出与ZmCLE7弱启动子等位基因相似的作用。
综上所述，该研究采用适当的策略操纵CLV-WUS途径可以产生新的等位基因，并进一步平衡分生组织的活性并定量地改变性状，从而提高农作物的产量，表明了编辑启动子以产生多样的顺式调控等位基因进行选择将可能成为设计育种玉米的一种实用且常规的策略。
图，用两种策略编辑CLV-WUS途径中的三个CLV3直向同源物，可定量提高玉米产量。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41477-021-00858-5
3. 2022年4月21日，Nature Biotechnology杂志在线发表了来自中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队题为“Targeting a gene regulatory element enhances rice grain yield by decoupling panicle number and size”的研究论文。该研究通过基因编辑技术改造IPA1基因的启动子，分别调控其在幼穗、茎基部等各组织中的表达水平，实现不同表型的特异性调控，从而打破产量因素之间负效应的策略，实现了穗重和穗数同时增加、株高变高、茎秆和根系粗壮的表型。
水稻是最重要的主粮作物之一，养活了世界一半以上的人口。水稻产量主要由三个核心要素决定：穗数、每穗粒数、粒重。然而，这三个性状在水稻中通常呈负相关。IPA1（Ideal Plant Architecture 1）是水稻株型调控的主效基因，编码一个包含SBP-box结构域的植物特异转录因子，调控水稻多方面生长发育过程，对抗病性和环境适应性也有重要调控作用。其功能获得基因型ipa1-1D和ipa1-2D能够使穗部增大、无效分蘖减少、茎秆粗壮、根系发达，最终显著提高产量，已广泛应用于优良水稻品种的培育。但IPA1是一个典型的多效性基因，在增大穗部的同时使分蘖数降低，限制了其增加水稻产量的潜力。
为突破IPA1多效性造成的穗部和分蘖的制约关系，在此项最新的研究中，研究团队提出了通过改造IPA1的顺式调控区，分别调控其在幼穗、茎基部等各组织中的表达水平，实现不同表型的特异性调控，从而打破产量因素之间负效应的策略。但由于之前技术方法的制约，对作物顺式调控区功能的研究极为缺乏，而对IPA1顺式调控区的功能研究也知之甚少。该团队使用平铺删除(tiling deletion)的方法，通过多靶点CRISPR/Cas9对IPA1的顺式调控区进行系统性高覆盖度的片段删除，创制出大量IPA1顺式调控区平铺删除的基因编辑材料，并从中发掘出了一个可以同时提高分蘖数和穗粒数的编辑材料IPA1-Pro10及其对应的54bp关键顺式作用元件。IPA1-Pro10具有穗重和穗数同时增加、株高变高、茎秆和根系粗壮的表型。经田间小区测产鉴定，IPA1-Pro10与对照品种中花11相比能够增产15.9%，大大提高了水稻产量。随后，该研究进一步阐明了IPA1顺式调控区调控穗部表型的分子机制，发现驯化关键转录因子An-1能通过结合54bp关键顺式作用元件中的一个GCGCGTGT基序特异调控IPA1在幼穗的表达水平，进而特异调控穗部表型。此研究通过平铺删除策略，通过编辑筛选水稻关键基因的顺式调控区成功实现了水稻产量关键要素间负相关性的解除，为通过创制全新遗传资源打破水稻产量瓶颈提供了有效策略。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01281-7.pdf
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