以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者朱盎岐
蛋白质在不同环境中、与不同的配体结合都会发生复杂的构象改变，然而通过观察瞬时的构象改变非常困难。单颗粒冷冻电镜技术（cryo-EM）可以解析蛋白质在非晶态冰内的高分辨率结构，但是传统cryo-EM中承载样品载网（grid）的制备需要将样品通过滤纸吸干，从样品吸附到载网再到液态乙烷中冷冻需要几秒的时间。因此，许多蛋白质在短暂时间存在的瞬时构象无法通过传统的cryo-EM来解析。
使用时间分辨冷冻电镜（time-resolved cryo-EM，trEM），可以捕捉并解析蛋白质瞬时构象的高分辨率结构。通过混合样品或者闪光光解来启动反应，并根据目标时间进行迅速冷冻来制备承载样品的载网。最早可追溯于1991年创建了闪光光解的样品制备器【1】，及后来基于混合的样品制备器【2】，这些方法被用来研究晶体中细菌视紫红质【3】和乙酰胆碱受体【4】的瞬时构象。随后，将微流体混合器与气体辅助雾化器【5】【6】或电喷雾【7】偶联，用来研究核糖体【8】和肌动蛋白-肌球蛋白相互作用【7】的动态变化。最新的进展发生在2020年，通过叠加由压电喷射器产生的微滴，在载网上进行混合，以实现约100毫秒的时间分辨率【9】。尽管在方法学发展方面已经有30年的历史，但由于样品消耗过多、EM载网的重复性差、以及时间分辨率最高只能100毫秒，这种高潜力trEM技术仍然难以应用。
2023年8月18日，来自比利时法兰德斯生物科技研究院的Rouslan G. Efremov在NatureMethods上发表了题为Time-resolved cryo-EM using a combination of droplet microfluidics with on-demand jetting的文章，开发出了将快速低消耗微流体混合器与激光诱导的微射流喷雾器相结合，允许反应快速启动并快速冷冻为电镜样品，最快可以5毫秒完成样品制备。此外，可以使用20 μL蛋白质溶液来制备10个载网，达到了对蛋白质的低消耗，适用于稀有的蛋白质。为了验证样品结构解析的可行性，作者首先对大蛋白质（去铁铁蛋白和β-半乳糖苷酶）进行混合并解析到了2.1 Å的高分辨率，还使用了GroEL：GroES蛋白质复合物进行trEM实验，观察到了复杂的动态变化并捕获其瞬时构象。
首先，作者设计并制作了制样装置，使其以小体积液体在短时间内混合并喷射到载网上。在制样装置中（图1a），首先两种溶液混合为油相中的液滴，然后液相油相分离，液相进入喷嘴部位，喷嘴处有脉冲激光，液相中的染料吸收激光的能量会在微秒内产生气泡，气泡会变大并瞬间破裂，使液体喷射至载网处（图1b）。其中，油的压力可以改变混合液滴的流动速度，从而影响液体在装置内的停留时间，为2～50 ms（Tchip）（图1c），在喷嘴处每毫秒可以产生3～6个液滴。激光会直接照射到约3%的液体体积，除了直接照射外还有额外约10度的热量改变，所以会造成蛋白质样品活性的降低，作者进行定量分析发现至少80%的蛋白活性可以保留，蛋白停留时间越短，活性越低。
整个制样时间（Treaction）可以分为三部分：装置内停留时间（Tchip），喷嘴液体喷射至载网的时间（Tflight）和载网插入液态乙烷的时间（Tplunge）。Tflight时间短于200 μs，因此制样时间主要取决于Tchip和Tplunge。载网固定在可旋转的音圈马达上，可以控制载网插入液态乙烷的时间（图1d），Tplunge最短为2 ms。
图1 制样装置的设计与性质
接下来，作者想要检测这一制样装置的样品数据收集与处理质量，使用了最常见的测试蛋白，去铁铁蛋白（分子量487 kDa）和β-半乳糖苷酶（分子量464 kDa），将两种蛋白溶液进行混合制样，分为三个条件，制样时间分别为5, 35, 和205 ms（图2b）。作者首先使用碳膜载网，发现很多孔都是空的（图2a大图），随后会换成2nm连续碳膜载网，发现效果较好，适宜数据收集（图2a小图），冰的厚度也较为适宜（图2c）。可以发现每张照片都有两种蛋白的混合（图2d），最后将去铁铁蛋白解析到2.1 Å，将β-半乳糖苷酶解析到3.3 Å。
图2 基准蛋白测试制样装置
作者接下来想要探究这一装置可否研究蛋白质的动态构象，使用了GroEL–GroES蛋白质复合物，GroEL是ATP酶，是由14个单体形成的两个7单体圆环堆叠而成。GroES可以结合在圆环的顶端。先前的荧光共振能量转移实验发现，GroEL结合ATP后会在几毫秒内发生快速的构象变化，然后与GroES结合发生缓慢的构象变化。作者在一个通道内提供GroEL，另一个通道内提供GroES和ATP（GroES 13ms的条件不提供）进行样品制备，时间分别为13，50，200 ms。20s的样品则使用传统的样品制备方法。复合物三维重构结果如图3所示。
图3 时间分辨的GroEL–GroES复合物的三维重构
可以发现随着时间的增加，GroEL单体逐渐减少，而GroEL-GroES, 和 GroEL–2GroES的复合物逐渐增加（图4）。
图4 GroEL, GroEL-GroES, 和 GroEL–2GroES的比例随时间变化
综上，作者设计出了一个可以最短5 ms内完成制样的装置，可以用于时间分辨冷冻电镜来研究蛋白质的动态变化，捕捉瞬时构象。最后作者总结了这一装置的优点与不足。
优点：
（1）时间分辨率高：液体装置停留时间最短2 ms，插入乙烷时间短于3 ms，可以在最短5 ms内完成液体混合。
（2）液体消耗量少：10个载网只需要20 μL的蛋白溶液。
（3）冰厚度适宜：微液滴喷射至载网，平均冰层厚度小于100 nm。
不足：
（1）激光损伤：本文使用的蛋白质对于激光不敏感，可能有其他蛋白易被激光损伤；同时激光染料可能对于样品的性质也会产生影响。
（2）载网选择：本文使用了连续碳膜的载网，未来可能石墨烯的载网更适宜用来进行结构解析。
（3）装置内时间控制：只能最多停留在装置内50 ms，如果想要延长反应时间只能延长插入液态乙烷的时间，在载网上等待，这可能会导致样品进入气液界面造成损伤，未来可以设计不同的体积的装置来改变停留时间。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41592-023-01967-z
参考文献
参考文献
【1】Ménétret, J. F., Hofmann, W., Schröder, R. R., Rapp, G. & Goody, R. S. Time-resolved cryo-electron microscopic study of the dissociation of actomyosin induced by photolysis of photolabile nucleotides. J. Mol. Biol. 219, 139–144 (1991).
【2】Berriman, J. & Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy 56, 241–252 (1994).
【3】Subramaniam, S. & Henderson, R. Molecular mechanism of vectorial proton translocation by bacteriorhodopsin. Nature 406, 653–657 (2000).
【4】Unwin, N. Acetylcholine receptor channel imaged in the open state. Nature 373, 37–43 (1995).
【5】Mäeots, M. E. et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nat. Commun. 11, 3465 (2020).
【6】Lu, Z. et al. Monolithic microfluidic mixing–spraying devices for time-resolved cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 168, 388–395 (2009).
【7】Kontziampasis, D. et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ 6, 1024–1031 (2019).
【8】Fischer, N., Konevega, A. L., Wintermeyer, W., Rodnina, M. V. & Stark, H. Ribosome dynamics and tRNA movement by timeresolved electron cryomicroscopy. Nature 466, 329–333 (2010).
【9】Dandey, V. P. et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nat. Methods 200, 1–12 (2020).
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