功能失调性子宫出血（DUB）又称功能性子宫出血或功血，是由于下丘脑–垂体–卵巢轴异常引起神经内分泌功能失调，影响体内雌孕激素水平，导致的非正常子宫出血[1]。DUB是一种临床常见妇科疾病，占10%～15%，50%发生在更年期，30%发生在生育期，20%发生在青春期。目前临床治疗DUB以止血为主要目标，常用的办法是刮宫加激素治疗，通过刮宫达到快速止血的目的[2]，辅以对患者内分泌的调理，在疗效和康复方面不能令人满意，只能暂时性地压制临床症状的发展或者恶化，常因防治不彻底导致复发，因此亟需疗效确切的治疗药物。
苗药土大黄为蓼科植物尼泊尔酸模Rumex nepalensis Spreng.、齿果酸模Rumex dentatus L.或羊蹄Rumex japonicus Houtt.的新鲜或干燥根及根茎，苗药名“锐马欲”。药用始载于《神农本草经》：“味苦，寒；主头秃疥瘙，除热女子阴蚀”。贵州少数民族及民间应用较多，2022年7月被收载于贵州苗族等少数民族药材目录（第一批）。苗药土大黄味苦，性寒，具有清热解毒、止血收敛、杀菌止痒的功效，临床用于防治热型痰、黄疸、便秘、疥疮、疥癣和多种出血症等疾病[3-4]，对DUB有独特的防治作用[5]。土大黄主要化合物包括蒽醌类、黄酮类、二苯乙烯类、萘及萘醌类成分[4]。目前，对于土大黄防治DUB研究及作用机制研究比较欠缺。本研究采用网络药理学结合分子对接技术初步探索土大黄对DUB的防治作用和可能的作用机制，筛选并获得土大黄防治DUB的有效活性成分及作用靶点，为其后续研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 土大黄活性成分及靶点筛选
由于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库未收录“土大黄”，查阅相关文献收集土大黄化学成分，将化学成分通过PubChem数据库（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索土大黄化学成分的Canonical SMILES号，导入Swiss Target Prediction平台（http://www.swisstargetprediction. ch/）进行“Predict targets”，点击“send to Swiss ADME”链接通过Swiss ADME（http://www. swissadme.ch）了解成分的胃肠道吸收性、类药性以及能否穿透血脑屏障；其他Pubchem数据库未收录的化学成分，将其化学结构式录入Swiss Target Prediction平台下的Swiss ADME功能项，得到其SMILES号，再进行“run”胃肠道吸收性和类药性等分析。Pharmacokinetics项下GI absorption满足High，同时Druglikeness项下Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5项特性中3项为Yes[6]，筛选出成分作为候选活性成分，将候选活性成分的Canonical SMILES结构导入Swiss Target Prediction平台（http://www.swisstargetprediction.ch/），选择物种为“Homo sapiens”，查找活性成分所对应的药物靶点。对所得到的全部靶点进行筛选，去除P＝0的靶点和重复靶点。利用UniProt数据库对所有靶基因名称进行校正，获得靶点信息。
1.2 疾病DUB靶点检索及共有靶点筛选
以“dysfunctional uterine bleeding”为检索词，利用GeneCards数据库（https://www.genecards.org）获取DUB相关靶点，依据“Relevance score≥10”进行筛选，在OMIM数据库（https://www.omim. org/）、DisGeNet数据库（http://www.disgenet.org/）、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com）中再次搜索DUB获得与其相关的靶点；将挖掘得到的DUB相关靶点与土大黄靶点导入Venny 2.1.0 （https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中进行匹配映射，获得两者交集靶点即土大黄防治DUB的关键作用靶点。将交集靶点导入String数据库（https://string-db.org/ cgi/input.pl）中，构建蛋白相互作用网络（PPI），蛋白物种设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“high confidence＞0.900”，并隐藏游离的靶标，其余参数保持默认设置，进而得到土大黄防治DUB的PPI网络。
1.3 核心靶点的筛选
将PPI网络图下载TSV格式并上传至Cytoscape 3.8.2软件，利用“Analyze Network”功能拓扑分析，使用度值、介值中心度、紧密中心度3个拓扑参数同时满足排名前10作为筛选条件，筛选出核心靶点。
1.4 “土大黄–活性成分–共有靶点”的网络构建
将预测的土大黄靶点、药物活性成分、土大黄–DUB交集靶点导入Cytoscape3.8.2软件中，绘制“土大黄–活性成分–共有靶点”网络。利用“Analyze Network”功能进行拓扑分析，使用度值、介值中心度、紧密中心度3个拓扑参数同时满足排名前10作为筛选条件，筛选出核心活性成分。
1.5 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
使用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/ home.jsp）对共有靶点核心靶点进行GO和KEGG富集分析，GO生物功能分析主要包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）以及分子功能（MF），将这3组数据以P＜0.01的条件分别进行筛选，并各取前10个条目，即组成30个条目在“微生信”在线绘图工具中制成柱状图进行可视化；KEGG富集分析筛选出P＜0.01的条目，将前20条通路制成气泡图进行可视化。
1.6 核心成分与核心靶点的分子对接
在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中下载关键活性成分3D结构的SDF格式，然后使用openbabel软件将化合物的SDF格式转化为PDB格式，导入Autodock Tools 1.5.7软件中加氢后导出为pdbqt文件。在PBD（https://www. rcsb.org/）数据库中下载核心靶点蛋白文件，使用Pymol软件去除水分子与配体，使用AutoDock TOOLs 1.5.7软件进行加氢后导出pdbqt文件。最后，将所得到的配体小分子和受体大分子一起导入Autodock Tools 1.5.7软件中，计算得到相应的结合能数据。使用Pymol软件绘制土大黄关键活性成分与核心靶点蛋白之间的模式图，将关键活性成分与各自对应打分最高的核心靶点分子对接进行可视化。
2 结果
2.1 土大黄有效成分与靶点的筛选
查阅文献获得土大黄相关活性成分45个，通过Swiss ADME和Swiss Target Prediction平台预测后得到符合条件的活性成分26个，见表1。共1 173个靶点，去除重复值得到392个潜在靶点。
2.2 疾病靶点及共有靶点的筛选
通过DisGeNet数据库、DrugBank数据库、GeneCard数据库和OMIM数据库搜索DUB相关的疾病基因，最后得出DisGeNet数据库17个基因，DrugBank数据库52个基因，GeneCard数据库348基因、OMIM数据库50个基因，共得到467个基因疾病靶点，删除重复值，获得DUB相关基因疾病靶点436个。使用Venny 2.1.0平台对392个土大黄药物靶点与436个疾病靶点进行互相映射，共获得交集靶点74个。
2.3 PPI网络图的构建及核心靶点的筛选
将得到的土大黄与DUB 74个共有基因导入STRING数据库进行蛋白相互作用分析，结果显示，网络共包含74个节点，206条边，平均节点度值为5.57。保存其TSV格式导入到Cystoscape 3.8.2中进行拓扑分析，见图1。共获得62个节点和218条节点之间的连线（剔除4个游离靶点）。图中节点的大小和颜色根据度值来显示，度值越大，节点越大颜色越深，即靶点的作用越重要。根据度值、介值中心度、紧密中心度同时排名前10位，筛选出7个核心靶点，分别为STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、ESR1、AKT1、RELA，其拓扑分析结果见表2。
2.4 “土大黄–活性成分–共有靶点”网络的构建
将土大黄及26个活性成分，74个关键靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中构建“土大黄–活性成分–共有靶点”网络图，见图2。图中共包括101个节点（74个圆形节点为核心靶点，26个菱形节点活性成分，1个六边形节点为苗药土大黄），278条边。利用“Analyze Network”功能进行拓扑分析，度值、介值中心度、紧密中心度同时排名前10位的核心活性成分有9个，分别为槲皮素、阿魏酸、豆蔻酸、羟基大黄素、决明柯酮、大黄素甲醚、委陵菜酸、大黄酚、3,4-二羟基苯甲酸乙酯，其拓扑分析结果见表3。
2.5 GO功能富集分析
通过David数据平台进行GO功能富集分析，得显著性GO条目303个（P＜0.01），其中BP 217个条目，CC 30个条目，MF 56个条目，各选取前10个条目，共组成30个条目在“微生信”在线绘图工具中绘制GO功能注释分析柱状图，见图3。结果显示，在土大黄有效成分防治DUB的潜在靶点中，BP主要集中在信号传导（signal transduction）、RNA聚合酶II启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）和对外源性刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）等；CC主要集中在质膜（plasma membrane）、胞浆（cytosol）和细胞质（cytoplasm）等；MF主要集中在蛋白结合（protein binding）、相同蛋白结合（identical protein binding）和ATP结合（ATP binding）等。
2.6 KEGG通路富集分析
通过David数据平台进行KEGG富集分析，得到122条信号通路（P＜0.01），选取排名前20的通路进行可视化处理，绘制KEGG信号通路气泡图，见图4。结果显示，土大黄有效成分防治DUB的潜在靶点主要涉及HIF-1、PI3K-Akt等信号通路。
2.7 活性成分–核心靶点分子对接
将土大黄防治DUB的9个关键核心活性成分槲皮素、阿魏酸、豆蔻酸、羟基大黄素、决明柯酮、大黄素甲醚、委陵菜酸、大黄酚、3,4-二羟基苯甲酸乙酯分别与7个核心靶点STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、ESR1、AKT1、RELA进行分子对接，其结合能均小于0，说明这9种活性成分均能与7种核心靶点自发相互结合，见表4，其中大黄酚与SRC结合能最低，结合能为−31.13 kJ/mol。委陵菜酸与PIK3CA结合能为−30.33 kJ/mol；羟基大黄素与RELA结合能为−28.24 kJ/mol；大黄素甲醚与AKT1结合能为−28.16 kJ/mol；决明柯酮与AKT1结合能为−27.57 kJ/mol；豆蔻酸与SRC结合能为−26.15 kJ/mol；阿魏酸与STAT3结合能为−20.50 kJ/mol；槲皮素与SRC结合能为−20.13 kJ/mol；3,4-二羟基苯甲酸乙酯与AKT1结合能为−18.37 kJ/mol。选取9个关键活性成分与各自对应打分最高的核心蛋白可视化，其结合模式见图5。
3 讨论
近年来，DUB 患者逐渐增多，不仅会影响患者的生活与工作，重者还会由于出血过多导致休克危及生命安全，引起了社会和临床的广泛关注，且目前DUB的病因和发病机制尚未完全明确。现代医学认为DUB主要与患者精神过度紧张、劳累、营养不良或代谢紊乱、环境及气候改变有关，或与卵巢或黄体等因素所导致的内分泌紊乱有关，进而引起子宫出血的症状[7]。现在常用手术加激素治疗，存在子宫内膜会变薄和药物不良反应多等缺点，不能从根本上消除导致子宫异常出血的病因[8]。中医学认为，DUB属于“崩漏”的范畴，《诸病源候论》指出“冲任之脉虚损，不能约制其经血，故血非时而下”，其主要病机是冲任不固，不能制约经血，使子宫藏泻失常[9]，特点多为虚实夹杂，血热、血虚、血瘀并存，故治法当凉血、补血、活血并用，才能冲任得固，血海得充，达到血归其经的目的[10]。土大黄属于清热药，其主要用于因血分中有热而致的多种出血症，经过民间多年应用及临床研究证明苗药土大黄防治DUB有特效[11]，但其作用机制尚无系统性研究。
经文献查阅并进行筛选后得到土大黄防治 DUB主要活性成分26种，最后筛选出大黄酚和槲皮素等9种土大黄防治DUB关键活性成分。有学者研究发现，大黄酚口服或皮下注射，可缩短血液凝固时间，具有止血作用，降低毛细血管的通透性，改善血管脆性，缩短凝血时间等[12]；大黄酚及大黄素通过干扰三磷酸肌醇（IP3）诱导的钙释放机制，对激动剂诱导的血管收缩均有明显的抑制作用[13]。槲皮素是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等药理活性[14]，可以通过改变细胞周期进程、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制血管扩张，发挥抗肿瘤作用[15]。研究表明，槲皮素止血作用的增强与含量的增加有关[16]，还能靶向抑制核因子-κB信号通路转导作用于SRC，发挥抗炎活性[17]。此外，槲皮素还能通过激活蛋白激酶B（Akt）磷酸化，作用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信号通路，减少氧化应激，实现对血管内皮细胞的修复和保护作用[18]。由此进一步探讨土大黄主要活性成分防治DUB的作用机制，PPI分析显示，土大黄可能与STAT3、SRC、PIK3R1、PIK3CA、ESR1、AKT1、RELA等多个靶点产生协同作用，这些靶点分别通过调控炎症反应、激素合成、增殖与凋亡来有效控制子宫出血[19]。其中，AKT1是PI3K-Akt信号通路的下游蛋白，在血小板的活化中起关键作用，其作为Akt的亚型，可参与代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等多种生物学过程。实验研究表明，AKT1基因缺陷小鼠与正常鼠相比，其出血时间增加，凝血时间延长，且血小板聚集、分泌和扩散受损[20]。STAT3属于STAT家族成员之一，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起着关键作用，可促进促血管生成的关键调节信号的生成，介导细胞的生长、凋亡等过程[21]，是一种参与肿瘤发生和组织损伤的常见信号传导机制，能够参与调节伤口愈合和癌症，包括细胞侵袭和迁移、血管生成、凝血调节和干扰素诱导基因的抑制[22]。研究表明，STAT3表达与外周血中的下肢深层静脉血栓形成有关[23]。SRC基因是SRC家族的的成员之一，它是一种非受体酪氨酸激酶，SRC异常活化可以通过多种途径刺激肿瘤细胞的生长、浸润、转移，从而诱导体内新的血管生成。SRC家族激酶在介导血小板对血管损伤的快速反应中起核心作用[24]，磷酸化的SRC参与血小板黏附和聚集过程，并通过激活下游黏着斑信号通路等，参与黏着斑和血栓的形成，进而调节止血过程[25]。以上研究表明，土大黄可能通过大黄酚和槲皮素等作用于AKT1、STAT3、SRC等靶点发挥止血的作用。
GO功能富集结果显示苗药土大黄作用于DUB的核心靶点影响生物过程主要包括信号转导、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、基因表达的正向调节等，表明这些生物过程可能在DUB的发生和发展中体现了重要作用。KEGG通路富集分析表明土大黄主要是通过调控HIF-1、PI3K-Akt信号通路治疗出血。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是HIF-1的活性亚基，又是调节亚基，与雌激素产生、血管生成、细胞增殖和炎症等相关基因表关系密切。在低氧状态下，机体可通过调节HIF-1信号通路来维持内环境的氧稳态，抑制血管生成[19]。研究发现，HIF-1α可调控多种血管生成因子的表达，达到修复血管和止血作用[26]。通过降低HIF-1α的表达，降低模型大鼠炎症水平，并减缓血管的扩张及新生，能改变缺氧状态从而抑制血管新生[27]。PI3K为细胞内磷脂酰肌醇激酶，Akt是PI3K信号传导中重要的下游效应器，通过调控PI3K-Akt通路可以阻止血小板对纤维蛋白原的激活和黏附，抗血小板聚集，增强亲环素A的黏附，促进凝血因子的形成，从而发挥止血作用[28-31]。徐薇等[32]研究发现，通过调节子宫内膜组织PI3K信号通路的磷酸化水平促进组织细胞的抗炎作用和增殖作用，恢复血管功能，从而治疗子宫异常出血症。Zhang等[33]研究发现，小剂量脂多糖能够激活 PI3K-AKT信号通路，增加糖胺聚糖颗粒分泌到子宫腔，以增加黏液层的厚度，从而保护子宫。以上结果表明土大黄可能通过槲皮素和大黄酚等活性成分作用于AKT1、STAT3、SRC等靶点，调控HIF-1、PI3K-Akt信号通路的信号表达从而介导血小板聚集、血栓形成，达到止血的目的。
综上所述，本研究通过应用网络药理学及分子对接技术的方法对土大黄活性成分、靶点和作用通路进行分析，表明土大黄防治DUB的是多成分、多靶点、多通路协同的结果。土大黄可能通过AKT1、STAT3、SRC等靶点主要作用于HIF-1、PI3K-Akt信号通路发挥防治DUB作用，为其后续进一步深入研究提供了基础和参考。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：卢旭，李玲，张宁．基于网络药理学和分子对接探讨苗药土大黄防治功能性子宫出血的作用机制 [J]. 现代药物与临床, 2023, 38(7): 1597-1605.
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