背景：
肝纤维化是肝癌发生和发展的重要危险因素，肝癌包括肝细胞癌(HCC)和肝内胆管癌(iCCA)。利用细胞命运定位和单细胞转录组学技术的研究发现，静止的肝窦周围星状细胞(HSCs)是HCC和肝转移中活化的胶原生成HSCs和肝癌相关成纤维细胞(CAFs)的主要来源，在iCCA中，门静脉成纤维细胞也有贡献。同时，对单细胞、单核和空间RNA测序数据的综合计算分析显示，造血干细胞和CAFs之间存在明显的异质性，不同的亚群表现出独特的基因表达特征和功能。其中一些亚群在促进或抑制肝纤维化和癌变方面有不同的作用。
简介：
2023年8月7日，来自美国西奈山伊坎医学院肝病科的Scott L. Friedman教授课题组在Nat Rev Gastroenterol Hepatol（IF: 65.1）杂志上发表题为“Friend or foe? The elusive role of hepatic stellate cells in liver cancer”的文章[1]。在本文中，作者讨论了HSC亚群在肝纤维化中的双重作用，以及它们在肝癌的促进、进展和转移中的作用。作者回顾了HSC和CAF亚群之间的转录组学和功能相似性，强调了促进或预防纤维化和癌症的途径，以及这些途径产生的免疫学景观。正在进行的研究将为开发生物标志物、评估预后和产生HCC和iCCA预防和治疗的新疗法提供新的策略。
主要结果：
肝星状细胞（HSCs）
细胞生物学和功能。
造血干细胞在胚胎学上来源于横隔内的间充质前体。在人类妊娠第4周和小鼠胚胎第9.5天，被困在入侵的肝母细胞(肝细胞前体)和内皮细胞之间的间充质前体获得了成人造血干细胞的形态学特征。这些特征包括树突样过程，形成星形或星形外观，细胞质脂肪滴成为人体维生素A的主要储存场所。在小鼠中，HSC祖细胞表达间充质标记物，包括Msx2和Alcam，以及神经元标记物Gfap和p75NTR，而成熟的HSC可以通过表达Des和Lrat来检测。这一发展轨迹已经通过hsc选择性Cre重组酶介导的谱系追踪和细胞耗散，以及基于单细胞RNA测序(scRNA-seq)的小鼠和人类肝脏发育不同阶段的细胞轨迹预测得到验证。
新出现的HSC异质性概念。
scRNA-seq、单核RNA测序(snRNA-seq)和空间转录组RNA测序(stRNA-seq)技术以前所未有的分辨率揭示了健康和患病肝脏中的细胞亚群。从技术角度来看，NPCs的scRNA-seq分析可能低估了它们的数量，因为肝组织的酶解和细胞分离技术有利于其他细胞类型的恢复。相比之下，snRNA-seq可以恢复更多的NPCs，包括造血干细胞，并且还可以从冷冻保存的组织中进行基因表达分析，这是scRNA-seq无法做到的。这两种技术都不能确定基因表达的空间定位。传统的基于形态学的方法，如免疫组织化学和荧光原位杂交，通常仅限于少数候选标记，尽管检测标记数量增加的能力正在迅速扩大。为了克服这些限制，stRNA-seq已经开发使用条形码技术，通过执行原位测序来捕获RNA信息。尽管stRNA-seq可以有效地检测肝脏结构内的大尺度空间基因表达模式，但目前仍需要更灵敏的方法scRNA-seq和/或snRNA-seq的补充使用，以达到单细胞分辨率。此外，HSC亚群的原位分布可以通过整合的计算机分析和使用stRNA-seq数据的细胞反褶积来推断。综上所述，这些发现说明了肝组织中单细胞分辨率方法的技术局限性和潜在应用，突出了snRNA-seq作为HSC分析的有利方法。
图1：基于单细胞分析的HSC和CAF活化后塑性假设模型
肝癌
形态与分子特征。
HCC和iCCA表现出不同的突变谱，CTNNB1、TP53和TERT启动子在HCC中频繁突变，而在iCCA中，IDH1/2突变和FGFR2融合是常见的，这为这种恶性肿瘤的首次靶向治疗奠定了基础。HCC和iCCA可分为两种主要的基于转录组学的表型类型，HCC中称为“增殖”和“不扩散”，iCCA中称为“增殖”和“炎症”，这两种增殖类型之间存在一些基因组相似性。独特的分子和组织学特征区分了两种HCC类型，增殖类型(约50%的肿瘤)与HBV感染相关，分化差，预后较差，促增殖途径和TP53突变率增加。相反，不扩散组(~50%)具有更好的结果，并且与CTNNB1突变相关的WNT信号占主导地位。同样，分配给增殖和炎症类别的iCCAs在结果、组织学和途径激活方面表现出差异，分化良好的肿瘤富含炎症途径。在过去的几年中，基于HCC或iCCA的免疫特征的分类已经出现。这些努力已经确定KRAS基因(~ 25-40%)和CTNNB1基因(~30%)的突变分别是iCCA和HCC中免疫抑制和免疫逃逸的驱动因素，进一步阐明了我们对其分子发病机制和对当前免疫疗法耐药的潜在机制的理解。
病因特异性HCC微环境。
潜在的慢性肝脏炎症在HCC的发病机制中起重要作用，有新的证据表明肝癌发生的病因依赖、免疫相关机制。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染引发免疫反应，可促进或抑制癌变。尽管T细胞可以有效识别HBV特异性表位并可能有助于肿瘤控制，但HBV感染主要与免疫耐受微环境有关，其特征是:(1)与生存率低相关的高度免疫抑制调节性T (Treg)细胞;(2)丰富的髓源性抑制细胞(MDSCs)能有效抑制T细胞;(3)产生IL-10的未成熟B细胞能够抑制HBV特异性CD8+ T细胞反应。
转移性肿瘤微环境。
肝脏独特的微环境对于通过血液或淋巴管支持源自其他器官的肿瘤细胞的播种至关重要。虽然多种原发肿瘤都可能是肝转移的起源，但原发性结直肠癌占转移性肝癌病例的一半，其次是其他原发性胃肠道癌症(如胰腺癌和胃癌)和原发性非胃肠道癌症，包括肺癌、黑色素瘤和乳腺癌。引人注目的是，转移性肝癌的发病率是原发性肝癌的18-40倍，5年生存率也大大降低。肝转移的机制尚未得到很好的研究，其特征是否主要是肿瘤特异性的尚不清楚;然而，肿瘤细胞与常驻肝细胞或免疫细胞之间的串扰可能有助于产生促转移的生态位。库普弗细胞是对抗肿瘤细胞播种的第一道屏障，并有助于在早期阶段通过吞噬消除肿瘤细胞。然而，在晚期，Kupffer细胞极化的改变诱导生长因子(如TNF和TGFβ)的分泌，促进细胞生长和血管生成或免疫抑制细胞的募集。
图2：CAF亚群在肝肿瘤微环境中的作用
肝癌相关成纤维细胞。
癌症相关成纤维细胞（CAFs）在组织间的异质性。
2022年发表的一项针对10种常见实体癌症类型的泛癌症分析描述了CAF的起源，其中确定了三种不同的CAF状态，每种状态都具有特定的功能。在这项研究中，CAFs被认为可能来源于局部正常成纤维细胞的活化，而具有内皮样、巨噬细胞样或周围神经样特征的小细胞团的存在可能反映了其他细胞类型的来源或来自常驻成纤维细胞的转分化。尽管存在巨大的表型和功能异质性，并且使用了不同的分类或选择技术，但在不同的癌症中已经出现了常见的CAF亚型，包括在胰腺、结直肠癌、乳腺癌和头颈癌中一致发现的主要αSMA表达亚群。
CAFs在肝癌发生和发展中的作用。
CAFs可以通过直接刺激癌细胞增殖、促进血管生成和重塑微环境来支持肿瘤发生。这些功能可以通过配体-受体相互作用、生长因子和炎症细胞因子的释放和/或ECM成分的沉积来发挥作用。特别是，CAFs介导胶原蛋白、纤维连接蛋白和蛋白聚糖等的分泌，它们与基质交联酶的分泌一起，有助于基质重塑，最终产生支持癌症生长和侵袭并增加组织硬度的“轨道”。刚性底物激活整合素、FAK、SRC家族激酶和YAP-TAZ信号传导，进而促进癌细胞和基质细胞中促增殖和促迁移基因的表达。为了响应这一信号，癌细胞可以进一步改变ECM的结构组织和组成。例如，YAP靶基因包括ECM组分和ECM修饰酶。
图3：肝星状细胞亚群是非酒精性脂肪性肝炎抗纤维化和抗肿瘤治疗的潜在靶点
治疗意义。
直接靶向纤维化细胞的新方法不如病因导向治疗先进，但可以通过减弱CAFs对癌症发展或进展的致瘤作用来影响肿瘤生长。动物模型表明，星状细胞可以通过给药HSC特异性CD8+ T细胞或嵌合抗原受体(CAR) T细胞直接消融。特别是，在实验性CCl4或NASH小鼠模型中，仅清除衰老星状细胞的CAR-T策略可减少纤维化，但其对HCC发展的影响尚未得到评估。衰老的造血干细胞还可能通过氨基末端启动的气真皮蛋白D分泌IL-33，从而促进致瘤环境的形成;用双硫仑堵塞这个孔可以阻止衰老HSC释放衰老相关的分泌因子，从而减轻小鼠肥胖相关HCC的肿瘤负担。在目前的一项小鼠研究中，使用工程化CD8+ T细胞消耗所有星状细胞导致肝细胞再生完全丧失，强调了HSC对肝脏稳态的重要性，以及需要改进任何消耗策略，以便仅去除促疾病的HSC，因为HSC还有助于维持肝脏稳态，调节肝脏再生和加速伤口愈合。
靶向与CAF相互作用的其他肝细胞群也正在研究中。一旦被激活，HSC与巨噬细胞进行更多的串扰，因此可以通过增强促炎促纤维化巨噬细胞的活性间接促进纤维化。虽然肝纤维化中基质降解蛋白酶的来源尚未确定，但巨噬细胞可能是一个来源，因此通过CAF调节其功能可能会改变其蛋白水解活性。
结论和展望：
尽管它们明显存在于肝肿瘤中，但在癌症基质中纤维性细胞的身份和行为一直没有得到充分的研究，直到最近才被仔细研究，这是由于单细胞技术的发展揭示了显著程度的细胞异质性。同时，这些技术帮助解决了支持纤维化细胞在肝脏和胆道癌发生中的保护或致病作用的不同结论。尽管最近的研究结果对CAF对癌症的贡献提供了更深入的了解，但它们也明确了将这些发现转化为有效治疗的障碍。由于CAF表型可能具有高度可塑性，任何改变其功能的治疗都必须限制在促进而不是预防癌症的亚群中，尽管它们的可塑性使CAF成为一个移动的目标。
在肝脏方面，明确的肝细胞癌来源是HCC和肝转移中活化的HSC，以及iCCA中门静脉肌成纤维细胞的补充，这是一项重大进展，可以在此基础上建立未来的进展。高度靶向免疫疗法、细胞特异性递送方法、细胞-细胞串扰和稳定的表型特异性药物靶点的鉴定的不断完善，将逐步改变有效预防和治疗肝癌的前景。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41575-023-00821-z
参考文献：
[1] Cogliati B, Yashaswini CN, Wang S, Sia D, Friedman SL. Friend or foe? The elusive role of hepatic stellate cells in liver cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2023 Aug 7. doi: 10.1038/s41575-023-00821-z. Epub ahead of print. PMID: 37550577.
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