脱发影响着全球5000多万人，但治疗选择有限。尽管有证据强调了局部免疫细胞在调节毛囊（HFs）的生命周期中的重要作用，但准确的调节免疫细胞以直接促进头发生长仍未实现。为此，受皮肤免疫中的生理反馈来抑制微生物触发的炎症的启发，澳门大学王春明、南京大学董磊教授和温州医科大学肖健研究员联合开发了一种“暴露”具有特定活性的寡糖生物材料，以招募HFs周围的Treg细胞，从而加速小鼠毛发生长。通过可控的酶裂解来加工葡甘露聚糖多糖，获得了一系列具有更具体的趋化运动诱导功能的低聚糖组分。六糖（OG6）通过甘露糖受体介导的内吞作用和NOD1/2依赖的信号通路刺激巨噬细胞选择性表达Treg趋化剂CCL5，通过分子对接、抑制试验和Foxp3报告小鼠模型得到证明。皮内传递OG6到脱毛的小鼠皮肤，促进HFs周围的Treg动员，并刺激强健毛发的从头再生。本研究表明，从其亲本多糖中揭示寡糖精确的免疫调节功能，可能解决多糖生物材料的长期困境，多糖生物材料活性广泛，但异质性高，为设计具有提高特异性和安全性的基于糖聚糖的治疗工具开辟了新的途径。相关研究成果以“Unmasking chemokine-inducing specificity in oligosaccharide biomaterial to promote hair growth”为题于2023年8月11日发表在《Advanced Materials》。
进行可控的酶裂解获得了一系列的聚/寡糖材料，并筛选了其诱导Treg固定化趋化因子表达的活性。本研究首次发现一种六糖可以选择性地诱导小鼠皮肤中的CCL5的分泌，诱导Treg在HFs周围积累，从而导致毛发新生（图1）。
图1 揭开”聚糖生物材料的特定免疫调节活性，以促进头发生长的示意图
【转基因多糖和低聚糖的制备】
使用一种纤维素酶（EC 232-734-4）将GM多糖降解为不同的组分（图2A)。在24 h时达到了完全降解，在酶-底物质量比为1：30的情况下，获得了Mwavg为1389Da的GM寡糖（OG）库（图2B）。将OG池应用于亲水相互作用液相色谱（HILIC HPLC），在不同的保留时间内显示了6个主要的峰（图2C）。续用Sephadex G-25凝胶过滤层析纯化这些OG，并通过HPLC分析分析其纯度＞95%（图2D）。6个OG组分如图2E所示。
图2 “G-M”聚糖和低聚糖候选物的制备
【OG6特异性诱导巨噬细胞CCL5释放而不极化】
较大的GM片段和较小的OG样本均未触发趋化因子释放；中间的3个样本GM15、OG6和OG5分别刺激了1个（CCL1）、1个（CCL5）和4个（CCL2、5、7、8）趋化因子的表达（图3A）。其中OG6暂时为六糖部分，特异性刺激CCL5的表达（图3B）。进一步证实OG6在骨髓源性巨噬细胞（BMDM）中以剂量依赖的方式增加表达（图3C）。流式细胞仪分析证实，与典型的“经典”激活（BMDM-M1）或“选择性”激活（BMDM-M2）相比，OG6没有显著上调CD86或CD206的水平（图3D）。在趋化因子中，只有Ccl5被OG6显著上调（增加7.65倍），而Cxcl9仅增加3.43倍（图3E）。OG6对促炎或抗炎极化的典型标志物影响不大（图3F）。与细胞内NOD样受体（NLR）相关的变化发生了明显的变化，如Iif205、Ifi214、H2-Q7、H2-Q6等，在OG6处理的BMDMs组中显著上调（图3G）。
图3 在巨噬细胞中发现了一种具有选择性的CCL5诱导活性的葡甘露聚糖（GM）衍生的六糖组分（OG6）
【OG6处理后的巨噬细胞诱导Treg迁移】
通过流式分离出表达tdTomato的脾脏Treg细胞（图4A），将它们与GFP+BMDM（未处理、50或100uM OG6预处理或LPS预处理）或CCL5（1 ng/ml）共培养，以观察Treg在16小时内的迁移（图4B）。与未处理的BMDM组或CCL5组相比，含OG6组的Foxp3tdTomato迁移到下腔室的数量明显增多（图4C、D），表明OG6处理的BMDM可有效诱导小鼠Treg趋化。
图4 OG6处理后的巨噬细胞在体外诱导Treg趋化和迁移
【揭示支持OG6激活CCL5产生的机制】
甘露糖受体（MR，CD206）与GM六聚体的对接分数最低（图5A），代表最高的结合可能性。OG6（绿色）分别通过CYS 641（H供体）、ILE761（H供体）、ALA627（H受体）、ARG637（H受体）和GLN 760（H受体）的氢键形成与MR的碳水化合物识别域CTLD4相互作用(图5B）。用微尺度热电泳（MST）实验验证了对接数据，结果显示OG6与重组CD206相互作用的解离常数（Kd）为1.12 μM（图5C），表明OG6与CD206具有较高的结合亲和力。OG6进入细胞，但MR沉默却消除了（图5D、E），进一步表明MR在介导OG6内吞作用中的作用。MR沉默显著降低了OG6处理的BMDM中Ccl5的表达（图5F）。用细胞松弛素D处理BMDM显著降低了OG6诱导的Ccl5表达上调（图5G），而洋地黄苷处理增加了OG6的胞质量，刺激了Ccl5的表达（图5H）。因此，MR介导的内吞作用对于OG6刺激巨噬细胞产生CCL5至关重要。在OG6处理前，先用NOD1/2抑制剂（ML130）预孵育巨噬细胞显著降低了Ccl5的表达（图5I），表明NOD1/2参与了这一过程。在细胞中观察到OG6对NF- κB的激活和NOD抑制剂对这种激活的抑制（图5J），强调了NOD诱导的NF-κB激活导致的CCL5的产生（图5K）。
图5 巨噬细胞甘露糖受体和NOD1/2诱导的NF-κB信号通路介导OG6诱导的CCL5产生
【OG6局部处理可诱导小鼠毛发生长】
动物研究计划如图6A所示。分别在OG6处理后的第1、5、7、10、12、15、17和20天对小鼠拍摄了照片，OG6显著加速了生长期的开始，并诱导了毛发的生长（图6B）。进一步量化背侧皮肤色素沉着（图6C)和毛发覆盖范围（图6D)提供了一致的数据。在第15天收集的OG6处理小鼠的毛发强健而厚，显微镜下具有自然和健康的形态（图6E），直径约60 um，与空白组20um形成鲜明对比（图6F）。这些结果支持了OG6在促进头发生长方面的功效，而不需要额外的药物。
图6 OG6可促进小鼠的毛发再生
剃须后第7、10和15天的H&E染色显示OG6刺激HF再生（图7A、7、B），处理后第7天HF长度为300μm，第15天达到600 μm。组织学形态和Ki67 IHC显示，处理后第7天，OG6组完成了末期向生长期的过渡，处于IIIa期（图7C、D）。
图7 OG6加速了小鼠毛囊休止期向生长期的转变
【CCL5的分泌和Treg的积累介导了OG6介导的毛发生长】
与空白组相比，OG6显著上调了小鼠背侧皮肤局部CCL5的表达，在处理后第2天达到峰值，但在血清中并没有一直整体上调（图8A），显示了其有效性和安全性。进一步对CCL5和F4/80（巨噬细胞）的IF染色显示，OG6刺激了真皮中的巨噬细胞分泌CCL5（图8B）。评估了在皮肤和皮肤引流淋巴结中Treg的时间频率（图8C-F）。OG6处理的皮肤组织中CD4+Foxp3+Treg的比例在处理后第3天显著增加，并持续增加到第5天。观察处理后第0、2、3、5、7天皮肤切片中Ki67、Foxp3和CD34的IF染色显示HFs周围Treg的邻近性和积累增加（图8G、I），进一步支持了在局部产生的CCL5的趋化作用下，被招募的Treg和HFSCs之间的相互作用。OG6处理的HF在隆起和毛发生殖区第3天Ki67+细胞增加（图8H），证明OG6处理促进了HF生长期的开始，并随着HF周围招募的Treg的积累。使用共聚焦成像技术将被招募的Foxp3+ Treg细胞定位在Foxp3tdTomato报告小鼠体内（图8J）。
图8 OG6增加了小鼠毛发再生过程中局部CCL5浓度和Treg的积累
【总结】
综上所述，受到皮肤中微生物信号和免疫细胞之间的相互作用的启发，本研究发现了一种有可能刺激小鼠毛发生长的低聚糖生物材料（OG6）。通过酶解转基因多糖在高度可控的方式建立了一个简单的方案。通过刺激巨噬细胞产生一种关键的Treg特殊趋化剂CCL5，OG6在体外和体内都实现了精确的Treg招募和积累，反过来加速了HF的转变，促进了脱毛小鼠模型的毛发再生。总之，本研究提出了一种具有葡萄糖-甘露糖单位的六糖（OG6）作为一种潜在的临床局部治疗剂，并代表了一种非常规的、基于生物材料的脱发精确免疫治疗方法。此外，本研究中的方法为克服多糖的长期挑战提供了一个新的解决方案——多糖是最具吸引力的生物材料之一，具有多样化和丰富的生物活性，但在结构和功能上也具有高度复杂和异质性。
来源：BioMed科技
转自：“高分子科学前沿”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
