PBJ | 南京农业大学棉花遗传与种质创新利用团队发现野生种澳洲棉抗黄萎病新基因，参与JA通路正向调控棉花对黄萎病的抗性

黄萎病（Verticillium wilt, VW）是目前对我国棉花生产威胁最大的病害，常年造成产量和品质的严重损失。迄今由于人们对棉花抗病机制尚未完全掌握，广为栽培的陆地棉又极度缺乏抗源，因而培育抗病品种难度大，品种间杂交抗病育种进展缓慢。为了拓宽抗病基因来源，发掘新的抗病基因，棉花种质创新周宝良团队利用高抗黄萎病的澳洲野生二倍体棉，采用染色体工程、分子标记、辐照诱变、抗性遗传评价等技术进行种质创新，通过十多年的不懈努力，创制出了携带澳洲棉染色体片段的高抗黄萎病的陆地棉—澳洲棉染色体异易位系，采用遗传学、分子细胞遗传学、转录组学、基因组学、功能基因组学、基因转化等手段有机结合，鉴定出了澳洲棉重要的新型抗黄萎病基因GausRVE2，进一步通过酵母双杂、双分子荧光互补、荧光素酶分离试验（Split-LUC）、Pull-down 和Co-IP、ChIP-qPCR、EMSA和双荧光素酶（Dual-LUC）等系列体内、体外试验，发现该抗病基因为MYB类转录因子，与TPL/TPRs互作干扰NINJA招募TPL和TPR1，释放被JAZ抑制的转录因子MYC2，释放出活性的MYC2正向调节茉莉酸（JA）信号通路，激活对 VW 的抗性反应，精细调控抗黄萎病的新机制。研究还发现，尽管陆地棉本身存在有这个基因，但由于GhRVE2D的基因存在Indel导致了移码突变，因此只能编码一个截短的蛋白，从而严重干扰了的GhRVE2A基因对JA信号通路的调控，导致陆地棉失去抗病功能。进一步通过多种试验研究表明，外源的澳洲棉基因GausRVE2转入棉花后，可以恢复和强化GhRVE2A基因的抗病功能，使其抗病性更强，这一研究将为棉花抗性设计育种提供理论基础和新型基因资源。

作者通过筛选课题组构建的一套澳洲棉向陆地棉遗传递送的棉花材料，鉴定出一个抗黄萎病的陆地棉-澳洲棉易位系TA01-7G。随后，通过对TA01-7G根部接种Vd 的转录组进行测序分析，挖掘澳洲棉的抗病基因。比较TA01-7G和CK（无外源染色体片段的遗传背景材料）接种Vd后的转录组，发现外源染色体片段介导了TA01-7G在Vd感染后的转录重编程。易位系中特异的差异表达基因（DEGs）主要与 JA 信号防御通路相关。为了进一步确认 TA01-7G 中直接调控抗病性的基因，作者进行了加权基因共表达网络分析(weighted-gene co-expression network analysis, WGCNA)和病毒诱导的基因沉默（VIGS）和转基因过表达技术进一步鉴定出具有抗病功能的基因 MYB 类转录因子 RVE2，并对其抗性机制进行了深入研究。

TA01-7G 的黄萎病抗性评价

作者首先在拟南芥和棉花中异源过表达RVE2，转基因材料显著增强了对VW的抗性。随后，在拟南芥突变体以及转RVE2基因的烟草和棉花中干扰 JA 信号通路，均导致了RVE2介导的抗病能力丧失，这些结果表明JA信号GausRVE2介导的Vd抗性中起着至关重要的作用。

GausRVE2介导的抗病性依赖于JA信号通路

作者为了解析RVE2的抗性分子机制，通过酵母双杂交试验筛选RVE2可能的互作蛋白。结果表明 RVE2与TPLESS/TPL-related proteins（TPL/TPRs）蛋白互作。随后，通过双分子萤光互补试验（BiFC）、萤火虫荧光素酶分离试验（Split-LUC）、Pull-down 和体内 Co-IP试验验证了RVE2与 TPL/TPRs存在互作。多蛋白的Split-LUC、Pull-down和Co-IP试验表明RVE2与 TPL/TPRs的互作能干扰NINJA招募TPL和TPR1，进而释放被JAZ抑制的转录因子MYC2活性。而释放活性的MYC2正向调节JA信号通路，激活对 VW 的抗性反应。同时，ChIP-qPCR、EMSA和双荧光素酶（Dual-LUC）试验也表明，MYC2能结合RVE2的启动子，激活其转录，形成了反馈调节回路。

TPL/TPR1与GausRVE2和NINJA相互作用，而GausRVE2会减弱NINJA与TPL/TPR1的相互作用

MYC2直接与棉花RVE2的启动子结合，增强其转录

MYC2直接结合棉花RVE2启动子中G-box基序

在该研究中作者还通过对陆地棉自然群体的RVE2基因序列比对分析，发现了D亚基因组中广泛存在一个独特的截短RVE2，GhRVE2D。Dual-LUC 试验表明，GhRVE2D能够抑制MYC2对GhRVE2A 启动子活性的激活，而不能抑制MYC2对 GausRVE2和GbRVE2的启动子激活活性。

GhRVE2D干扰MYC2对GhRVE2A启动子的激活，但对GausRVE2启动子没有影响

综上所述，转录因子RVE2通过调控JA防御信号的输出，以增强棉花对VW的抗性。此研究阐述了RVE2在调节JA信号机制中新的见解，同时也提供了棉花对 Vd抗性反应的新途径，这为棉花抗性设计育种提供了理论基础。最后，作者也提出RVE2通过调控JA信号以增强对V. dahliae抗性的工作模型。南京农业大学农学院刘富杰博士为论文第一作者，周宝良教授为通讯作者。课题组已毕业博士生蔡升、岳浩然等在读研究生参与了研究工作。该研究得国家自然科学基金（31771845，31271771）、国家重点研发（2016YFD0100203, 2016YFD0102000）、新疆建设兵团(2019NY01, 2023NY09, 2023NY10)和江苏省研究生创新计划（KYCX21_0601）的资助。

RVE2在棉花防御Vd中精细调控JA信号的工作模型

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.14149

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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