原理易懂，结果难做——QPCR结果你会分析么？

本文介绍QPCR的结果如何统计分析。

将以案例的方式，针对不同实验目的来介绍如何设计实验和统计分析结果，本次介绍案例1.

案例1

假设我们有一个药物，加入细胞培养液中看他对于p53 mRNA水平的影响，那么如何设计实验组和对照组呢？如何分析结果？

实验设计

分别种两小皿（3.5cm）细胞，一皿加药，另外一皿加对照。处理一段时间之后，分别收细胞提RNA，逆转录，然后准备做qPCR，这个时候我们需要做的qPCR孔如下：

注意这里面要区别一个概念是“独立实验重复”和“PCR重复”，上面p53和GAPDH都有三个PCR孔，这是PCR重复，为了消除本次操作误差。独立实验重复指的是我们做的三次独立的重复试验，具体到本例中，就要求我们在其他时间做再种两小皿细胞，再提mRNA，再逆转录，再做qPCR，如此做了三次实验后才能算作独立实验重复，我们统计的时候统计的是独立实验重复，而不能单纯以上面三个孔作为统计误差的来源。

做完上述实验之后，我们得到如下的结果（下图中值均为Ct值）：

第一次独立实验Test1

我们再做两次独立重复试验，得到结果如下：

第二次独立实验Test2

第三次独立实验Test3

结果分析

下图为计算过程，是qPCR计算的核心所在，大部分同学都在此处不知如何计算

△Ct=Ct(p53)-Ct(GAPDH);

这里需要注意的是2^-△△Ct的计算，首先我们把对照里面的2^-△Ct求平均（上图中为0.000780573），然后用2^-△Ct 中的每一个数据除以这个数据，对照组也同样除。

接着我们再整理下数据：

那么这个就可以画出柱形图了~

虽然偏差都有了，虽然看上去相差那么大，如何确定P值呢。我们可以采用SPSS统计软件来统计P值，在此就不再说明，需要强调的是我们要确定用什么检验方法来检验显著性差异，因为我们是都是独立的样本，所以我们采用独立样本t检验方法来检验。SPSS的使用方法在这就不介绍了。（可以登录科研狗网站http://www.keyangou.com）。

最后强调下，这种方法只适用于单因素处理比较，这个因素（本例子中为加药）处理得到的结果应该是稳定的（表示在相同细胞中加相同浓度的药物，p53mRNA的变化水平也是一致的）。

在临床上我们经常会做到比较癌和癌旁中某种基因mRNA水平的差异，这种不能用上面方法，因为个体差异非常大，每个人的癌和癌旁都不一样，不能把每个人的癌和癌旁当作是独立实验的重复（Test1,Test2,Test3...），我们将在下一讲中介绍。

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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