导读
苓桂术甘汤（LGZGD）是一种经典的中药方剂。我们之前的研究发现，LGZGD可以逆转心力衰竭（HF）小鼠的脂质代谢紊乱。本研究旨在揭示LGZGD的脂质代谢调节。我们通过腹腔注射阿霉素建立小鼠心衰模型；用超高效液相四级杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）方法鉴定LGZGD的成分；通过血清脂质组学和心脏组织蛋白质组学检测LGZGD对脂质代谢的调节；进一步进行分子对接以筛选活性成分。我们共鉴定出78种LGZGD化合物。脂质组学结果显示，在LGZGD处理后，37种脂质表现出明显的恢复趋势。蛋白质组学结果表明，在HF小鼠中，服用LGZGD可改变55种蛋白质。经过富集分析，Apelin通路上的Prakg2/Ucp2/Plin1轴在LGZGD治疗HF中起着至关重要的作用。9种活性成分表现出与apelin受体结合的优异能力，MM-GBSA值低于−60 Kcal/mol。总之，所有结果结合在一起表明，LGZGD中的多组分通过改善脂质紊乱对HF具有有益作用，这为LGZGD的心脏保护作用及其临床应用提供了新的见解。
亮点：
1. LGZGD通过调节脂代谢关键蛋白代谢物网络发挥其治疗心力衰竭的作用；
2. 脂质组学和蛋白质组学分析表明，Apelin信号通路是LGZGD影响的关键通路；
3. Ampk/Ucp2/Plin1轴在LGZGD处理中起重要作用；
4. 筛选出9种与apelin受体结合的活性成分。
论文ID
原名：Revealment study on the regulation of lipid metabolism by Lingguizhugan Decoction in heart failure treatment based on integrated lipidomics and proteomics
译名：基于综合脂质组学和蛋白质组学的苓桂术甘汤治疗心力衰竭调节脂代谢的揭示研究
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
IF：7.5
发表时间：2022.12
通讯作者：王巧&孔德志
通讯作者单位：河北医科大学药学院和中西医结合研究所
实验设计
实验结果
1. LGZGD减轻HF小鼠心脏功能障碍
在整个实验过程中，9只心脏功能严重下降的小鼠被完全安乐死。其中4只小鼠来自模型组（MG）。3只小鼠来自比索洛尔处理组（BTG），2只小鼠来自LGZGD处理组（LTG）。
为了证实LGZGD对HF小鼠的治疗效果，我们进行了超声心动图分析。与正常组（CG）相比，MG的射血分数（EF）和缩短分数（FS）指数显著降低，提示心肌细胞损伤明显。与MG相比，LGZGD和比索洛尔处理显示出这些指标的显著改善，如图1A和B所示。
图1 评价HF模型和LGZGD处理的效果
（A）每个实验组小鼠的代表性M型超声心动图；（B）EF和FS的分析结果；（C）血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、IL-6、TNF-α、（NT-proBNP）和甘油三酯（TG）水平；（D-E）四组病理变化的代表性H&E染色和Masson染色。与CG相比*P<0.01，与MG相比**P<0.01。
为了进一步评估治疗效果，我们检测了血清中LDH、CK-MB、TNF-α、IL-6、NT-proBNP和TG的水平。结果表明，MG中这些生化指标的水平显著升高，而在LGZGD或比索洛尔处理后，这些生化指标水平显著降低，表明LGZGD对HF小鼠具有心脏保护作用，如图1C所示。
如图所示，1D和E、H&E染色和Masson染色结果描绘了四组心脏组织的光学显微镜图的结果。可以发现CG的心脏组织形态正常，而MG的心脏组织表现出明显的局灶性细胞质空泡化和间质纤维化。LGZGD或比索洛尔均能明显改善阿霉素引起的这些缺陷，提示LGZGD可减轻心衰心肌损伤程度。
图2 LGZGD在正（A）和负（B）离子模式下的基峰色谱
2. LGZGD成分鉴定
通过将化合物的信息与文献和数据库中的信息进行比较，我们共鉴定了78种化合物，包括三萜、黄酮类化合物、酚酸、皂苷等，11种化合物得到了明确确认。LGZGD的基峰色谱图（BPC）如图2所示。其详细的MS/MS信息和强度数据如表S1所示。
表1 用apelin受体（APJ）测定LGZGD活性组分的MM-GBSA值
3. LGZGD对脂质代谢产物的影响
为了研究LGZGD对阿霉素诱导的小鼠HF模型中脂质代谢的全身变化的影响，我们使用UHPLC-QTOF-MS对小鼠血清进行了脂质组学研究。图3A显示了在正（左）和负（右）离子模式下获得的代表性总离子色谱图。如图3B所示，PCA得分显示了MG和CG在正（左）和负（右）离子模式下的清晰分类，表明MG和CG中的脂质分布显著不同。此外，LTG或BTG也有其独特的分类，有一些重叠。
随后，我们分析了CG和MG之间脂质代谢产物的变化，发现MG中43种脂质升高，21种脂质下降。LGZGD处理后，37种脂质（包括FA、CE、甘油三酯(TG)、溶血磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰乙醇胺(PE)）显示出显著的恢复趋势（图3C）。与MG相比，LTG中12个PCs[PC (18:0/18:0), PC (16:0/18:3), PC (16:0/20:5), PC (16:2/18:1), PC (18:0/16:0), PC(18:0/20:1), PC(18:0/20:3), PC (18:0/20:5), PC(20:0/22:6), PC(20:0/18:2) PC(16:0/20:4), PC(20:0/20:4)], 5 TGs [TG (16:1/18:1/18:3), TG (18:1/18:2/18:3), TG (16:0/18:2/18:3), TG (16:0/18:2/18:3), TG (18:1/18:2/18:4)]、2个Lyso PE [Lyso PE(18:2)、Lyso PE(20:4)]和2个其他脂质代谢物[PS(16:0/13:0)、PA(22:1/22:2)]的水平呈增量变化。然而，与MG相比，LTG中三种脂肪酸（15-HETE、花生四烯酸、15S-HETE di-endoperoxide）、四种Lyso PC [Lyso PC (18:2), Lyso PC (20:0), Lyso PC (20:5), Lyso PC (20:4)]、五种PE [PE (20:0/18:2), PE (20:0/20:3), PE (18:0/20:4), PE (18:0/22:6) and PE (16:0/22:6)]和三种其他脂质代谢产物[TG (18:2/20:4/22:6), PC (18:0/20:4), PC (16:0/20:4) and CE (20:4)]的水平明显降低。表S2列出了详细信息。
图3 血清脂质测定结果
（A）QC样品的代表性总离子色谱法；（B）脂质、QC（绿色）、CG（深蓝色）、MG（红色）、LTG（黄色）和BTG（浅蓝色）的PCA评分图；（C）血清脂质组学潜在脂质生物标志物的热图。
4. LGZGD对蛋白质水平的调控
很难通过脂质代谢产物的改变来完全解释LGZGD的作用机制。因此，我们对心脏组织进行了蛋白质组学分析。在这项研究中，通过基于timsTOF的无标签蛋白质组学分析，我们研究了CG、MG和LTG中小鼠心脏组织的蛋白质表达谱。我们总共鉴定了3489种可信蛋白，并对其中3450种进行了定量。通过将蛋白质的表达水平与CG中的表达水平进行比较，我们确定MG中的124个蛋白质差异表达，其中44个蛋白质上调，80个蛋白质下调（表S3）。与MG相比，LTG中有55种蛋白被识别为差异表达，其中21种蛋白上调，34种蛋白下调（表S4）。在两次比较中对差异表达的蛋白质进行分析，我们发现只有15种蛋白质表现出回调趋势。来自基因本体论（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路以及差异蛋白的反应体途径的结果如图S1所示。不饱和脂肪酸的生物合成、PPAR信号通路、脂肪酸代谢和胆固醇代谢被发现是心力衰竭发生过程中受影响最大的KEGG通路。此外，脂肪酸β氧化、甘油三酯代谢过程、脂蛋白代谢过程和胆固醇代谢过程被发现是受影响最大的生物过程。在LGZGD处理中，Apelin信号通路、产热和PPAR信号通路被认为是受影响最大的KEGG通路。此外，对药物的反应、胰岛素分泌的正调节和脂肪酸生物合成过程是受影响最大的生物过程。综合分析富集分析结果，我们发现载脂蛋白A1(Apoa1)、Apoc1、Apoc3、Apoe和Lpl在HF的进展过程中有多个方面的富集。此外，与LTG和MG相比，Lpl、Ucp2、脂滴包被蛋白1（Plin1）和Prkag2显示出显著变化。这些蛋白质的表达如图4所示。值得注意的是，只有Lpl的表达呈现回调趋势，这表明LGZGD通过复杂的脂质调节而不是直接回调到紊乱蛋白来影响HF的进展。
图4 主要蛋白在不同组中的表达
（A）ApoA；（B）ApoC1；（C）ApoC3；（D）ApoE；（E）Lpl；（F）Ucp2；（H）Plin1；（I）Prkag2。与CG相比*P<0.05，与MG相比**P<0.05。
5. LGZGD活性成分的筛选
由于Ucp2、Plin1和Prkag2在apelin通路中富集，我们应用分子对接模型，通过LC-MS分析，检测LGZGD中检测到的成分与apelin通路的源头蛋白APJ的对接情况。
分子力学广义玻恩表面积(MM-GBSA)考虑到范德华、亲脂性、广义玻恩静电溶剂化和校正等能量，计算了配合体和受体的应变。APJ与9个配体的结合亲和力值(MM-GBSA值)显示，与夏佛塔苷的结合亲和力最好，其次是芹糖异甘草苷(表1)。我们使用MM-GBSA值低于-60 Kcal/mol的分子对接方法筛选了LGZGD中可以与APJ结合的活性成分。芹糖异甘草苷、夏佛塔苷、甘草香豆酮、羟基猪苓酸C、licuraside、去氢土莫酸、新异甘草苷、土莫酸和去氢齿孔酸被认为是可与APJ良好结合的活性成分。羟基猪苓酸C、去氢土莫酸、土莫酸和去氢齿孔酸是茯苓（LGZGD中君药）中的三萜类化合物，具有主要药理作用。其他成分来自甘草，甘草是LGZGD中的使药，具有调和功能。每个成分的结合复合物如图5所示。
图5 活性成分与APJ的分子对接（PDB ID:7SUS）
（A）APJ-去氢土莫酸复合物；（B）APJ与去氢土莫酸之间的相互作用；（C）APJ-夏佛塔苷复合物；（D）APJ和夏佛塔苷之间的相互作用；（E）APJ与其他七个活性成分之间的相互作用。
讨论
大量的临床研究以及我们之前的研究证实了LGZGD治疗心力衰竭的疗效。相应地，人们普遍认为LGZGD治疗HF的机制是通过调节脂质代谢来实现的。本研究旨在阐明LGZGD调节脂质代谢的机制。为了进一步证明，本研究广泛应用了多个参数。EF和FS结果表明，LGZGD可以恢复受损的心功能。此外，血清中CK-MB、LDH和NT-proBNP的回调水平说明了LGZGD对心脏的保护作用。血清中IL-6、TNF-α和TG水平也呈校正趋势。H&E染色和Masson染色结果表明，LGZGD可以改善心力衰竭心肌细胞的紊乱，减少炎症浸润，减轻HF心肌纤维化。比索洛尔是治疗HF的首选药物，在本研究中用作阳性对照药物。我们采用血脂组学和心脏组织蛋白质组学研究HF发展和LGZGD治疗过程中脂代谢的复杂变化。脂质组学结果表明，LGZGD在HF治疗中的作用与FA和TG的代谢高度相关。根据蛋白质组学的结果，Lpl、Ucp2、Plin1和Prkag2引起了我们的注意，它们与FA和TG的代谢有关。结合富集分析的结果，我们发现apelin途径非常关键。此外，我们已筛选出9种LGZGD活性成分，这些成分与APJ相关。详情如图6所示。
图6 LGZGD在脂质代谢中的调控机制
1. 阿霉素诱导HF小鼠脂代谢功能障碍
载脂蛋白（Apo）是人血浆脂蛋白的重要组成部分，在脂质代谢和脂质运输过程中调节各种酶的活性，促进脂蛋白配体结构的形成。Apo的异常表达通过影响脂质代谢过程促进心力衰竭的发展，最终导致血脂异常和疾病。在我们的研究中，HF小鼠心脏组织中ApoA1、ApoC1、ApoC3和ApoE的水平降低。ApoA1的过度表达能够保护小鼠免受DOX的有害心脏毒性作用。Apo-C1和ApoC3被认为是脂蛋白脂肪酶(Lpl)的负调控因子。类似地，载脂蛋白E（一种肝脏摄取乳糜微粒和VLDL残余物所需的载脂蛋白）也可能能够抑制Lpl活性。事实上，我们的结果表明，在MG的心脏组织中Lpl的表达增加。Lpl是全身脂质分配和代谢中最重要的因素之一。它介导脂蛋白如乳糜微粒和高密度脂蛋白（HDL）中的甘油三酯的血管内水解。Lpl水平的升高会导致大量TG分解成游离脂肪酸。
由于不间断的收缩是心脏的一个独特特征，心肌细胞对ATP形式的持续和充足的能量供应有强烈的需求。心脏中通过线粒体代谢产生的近70%的ATP来自脂肪酸（FAs）。心脏不能合成FAs，依赖于从其他来源获取，特别是通过Lpl将循环中的富含TG的脂蛋白脂解生成FAs。Lpl异常可能导致血清中FAs水平的剧烈变化，我们的结果证实了这一点，花生四烯酸，15-HETE升高。在之前的研究中，研究人员已经证明血浆FAs浓度与HF事件独立相关。高浓度的FAs导致心肌葡萄糖摄取和氧化减少，脂肪酸氧化增加，以及心肌细胞基因表达改变。不幸的是，持续改变FAs的供应和利用会导致线粒体ROS生成和氧化应激增强，最终导致心力衰竭。
2. LGZGD处理后脂质代谢的调节
脂滴包被蛋白（Plins）是位于脂滴表面的主要结构蛋白。脂滴（LDs）可能通过以TGs的形式介导FAs的瞬时储存而在脂质稳态中发挥关键作用。在脂滴包被蛋白中，Plin1充当脂质积聚或耗竭的“阀门”。在非磷酸化状态下，TG不能水解导致脂质沉积，而Plin1的磷酸化在能量缺乏期间促进三酰基甘油（TAG）脂解。与正常小鼠相比，Plin1-/-小鼠在20周龄时明显出现心肌肥厚，以及左心室收缩性心力衰竭。此外，Plin1通过Mfn2/Plin1复合物被证实是LDs与线粒体的接触位点。FAs依次从LDs运输到线粒体，在那里它们进行β-氧化以产生ATP。因此，LDs和线粒体形成一个功能性细胞器对，管理心脏细胞的能量稳态。LGZGD引起的Plin1过表达有助于FAs的快速氧化，最终降低脂质毒性。
解偶联蛋白2（Ucp2）是一种广泛表达的线粒体蛋白，作为阴离子载体，参与调节线粒体膜电位和活性氧的生成。Ucp2与多种病理状况有关，尤其是心脏病。Ucp2在心脏中呈组成性表达，其表达水平与FAs浓度有关。在阿霉素（DOX）处理的动物模型和心肌细胞中，Ucp2下调和随后的FAs积累也与严重的心脏毒性相关。有趣的是，服用LGZGD通过改善线粒体损伤和上调Ucp2来抵消DOX的心脏毒性作用。
AMP激活蛋白激酶（AMPK）是一种高度保守的异源三聚体丝氨酸/苏氨酸激酶，被广泛表征为细胞能量应激的传感器，它由一个催化α亚基和两个调节亚基（β和γ）组成。在哺乳动物中，有三种γ亚型，γ2-亚型（Prkag2）在能量平衡和心肌信号传导的调节中起着重要作用。在γ2亚基表达最高的心脏中，AMPKγ2复合物的基础活性增加是维持心脏特异性功能所必需的。此外，Prkag2有利于细胞存活和心脏保护。AMPK被AMP激活并被ATP抑制，但Prkag2的不正确表达会破坏体内稳态，这将导致ATP亲和力降低和能量代谢降低。Prkag2表达的增加可能通过增强能量代谢来改善心功能。
3. LGZGD多组分与APJ相互作用
根据富集分析的结果，Apelin途径引起了我们的注意。Apelin由77个氨基酸的前体肽原组成，其被血管紧张素转换酶剪切以形成几个较短的C端生物活性肽，如Apelin-13。越来越多的证据表明，Apelin及其孤儿受体APJ系统作为心血管稳态的关键介质，参与心血管疾病的病理生理学。靶向apelin/AAPJ轴可预防心血管疾病。在小鼠模型和人类患者中，心脏apelin和APJ的表达在心力衰竭阶段明显下调。口服APJ激动剂可持续增加心输出量，并改善心脏功能障碍和重塑。此外，全身静脉输注apelin-13会导致慢性心力衰竭患者的心功能指数持续增加。这些都意味着APJ激动剂可能具有补充目前心力衰竭最佳药物治疗的主要前景。
综合以上所有推论，我们认为，尽管LGZGD不直接调节导致HF的重要节点，如Lpl和Apos，但它通过多种活性成分协同激活APJ对HF发挥非常显著的治疗作用，进而调节下游通路上的Prkag2、Ucp2和Plin1。
尽管我们假设LGZGD通过多组学方法治疗HF的潜在作用机制，但我们仍需要进行体内和体外实验以进一步验证。
结论
本研究在体内证实了LGZGD治疗HF的作用，并展示了全局蛋白质和脂质代谢物的变化来解释脂质代谢的复杂变化。脂质组学研究表明，FA和TG的代谢在HF的治疗中起着重要作用。根据蛋白质组学分析，Lpl、Ucp2、Plin1和Prkag2蛋白的改变与脂质稳态异常相关。结合富集分析和分子对接的结果，已筛选出与APJ结合的9种LGZGD活性成分。本研究为LGZGD的开发利用提供了理论依据。然而，我们还需要对验证进行进一步的研究，特别是深入证明APJ相关蛋白在LGZGD机制中的作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36528915/
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