研究背景：
肺动脉高压（PH）的机制尚不完全清楚；此外，为何肺血管重塑发生在小动脉中仍然没有答案。VEGF（血管内皮生长因子）是血管形成和维持中的一个关键参与者，可能与肺动脉高压（PH）的发病机制有关。已有报道称，两名接受卵巢癌治疗的患者因使用VEGF受体的单克隆抗体（贝伐单抗）而发展出严重的PH。然而，此类副作用较为罕见，并且VEGF信号与PH之间的关联仍不明确。VEGF结合到两种特定的受体，Flk1和Flt1，并通过激活RTKs（受体酪氨酸激酶）调控血管新生，促进内皮细胞的增殖、迁移和存活。Flk1信号与发育和疾病中的血管新生相关，而Flt1在响应VEGF时的RTK活性较弱，起到Flk1的负调节因子作用。尽管Flk1和Flt1在血管重塑中具有重要功能，但它们在肺血管系统中的时空表达模式仍不为人们所熟知。
在动物实验中，通过酪氨酸激酶抑制剂SU5416抑制VEGF信号传导会加速慢性低氧环境下的血管重塑并恶化PH。体外实验显示，SU5416会导致内皮细胞死亡，随后是对凋亡抗性内皮细胞的异常增殖，这可能导致体内血管闭塞性病变。然而，SU5416的全身性应用会抑制多种细胞类型的RTK（包括Flk1、Flt1、PDGFR、c-Kit和RET）信号传导，限制了我们对内皮细胞Flk1功能在肺血管重塑中的理解。以往的SU5416/低氧实验主要使用肺组织的组织学，而不是对肺内皮细胞的全基因组分析。此外，由于纯合子Flk1缺陷小鼠会导致胚胎早期死亡，因此成年肺血管中Flk1的功能在很大程度上尚不明确。在本研究中，我们使用Flk1和Flt1报告小鼠来分析这两个基因在成年小鼠肺中的表达模式。我们还构建了Cdh5CreERT2/Flk1f/f/Tomato小鼠，以研究内皮细胞中Flk1在肺血管重塑中的作用。通过分析这些小鼠的报告基因表达、全局转录谱和肺内皮细胞谱系追踪，我们确定了PH中血管重塑的分子和细胞机制。
研究方法：
我们分析了多个报告基因小鼠，包括Flk1-GFP细菌人工染色体转基因（Tg），Flt1-DsRed细菌人工染色体Tg，以及Flk1-GFP/Flt1-DsRed双Tg小鼠，以确定Flk1和Flt1在缺氧诱导的PH中的时空表达。我们还使用Cdh5CreERT2/Flk1f/f/Tomato（Flk1-KO）小鼠在慢性缺氧中诱导内皮细胞特异性的Flk1缺失，并进行谱系追踪。
研究结果：
Flk1特异性表达在小型肺血管的内皮细胞，包括小动脉中。相反，Flt1在成年小鼠肺的内皮细胞中更广泛地表达在大到小血管。Flk1和Flt1在肺内皮细胞中高度且不同程度地表达。
图1. 成年小鼠肺中Flk1和Flt1的不同表达模式。
图2. 在缺氧（Hx）期间，Flk1-GFP+内皮细胞短暂增加。
有趣的是，Flk1+ECs在缺氧条件下通过增殖短暂增加，而Flt1表达保持不变。Flk1-KO小鼠在正常氧气条件下没有肺血管重塑和PH；然而，小动脉的ECs形态变为立方形并突出。在缺氧条件下，Flk1缺失加剧了EC功能障碍并通过凋亡减少了其数量。此外，Flk1缺失促进了小动脉中介质增厚和内膜形成，恶化了PH。本质上，谱系追踪揭示内膜细胞来自Flk1-KO ECs。
图3. 缺氧（Hx）条件下，Flk1-GFP+肺内皮细胞的转录谱。
图4. 柔红霉素（tamoxifen）诱导的内皮特异性Flk1敲除小鼠的构建。
图5. 内皮细胞Flk1缺陷在低氧环境（Hx）中促进内皮功能障碍、血管重塑和肺动脉高压。
图6. Flk1缺陷与低氧环境（Hx）的联合作用共同改变肺内皮细胞的转录谱。
此外，RNA测序显示，肺ECs中Flk1的缺失和缺氧协同激活了多条通路，包括细胞周期、衰老/凋亡和细胞因子/生长因子，同时抑制细胞黏附和血管生成，促进了血管重塑。
研究结论：
在这项研究中，我们揭示了Flk1和Flt1在低氧诱导的肺血管系统中的不同时空表达。内皮细胞特异性的Flk1缺失和低氧环境协同地改变了肺内皮细胞的全局基因表达，导致内皮功能障碍、血管结构的闭塞性重塑，并加重了肺动脉高压。据我们所知，这是首次利用RNA测序和谱系示踪研究了Flk1缺陷和低氧对肺血管结构重塑的细胞和分子机制。Flk1和Flt1在肺内皮细胞中表达不同。Flk1缺陷和缺氧共同调节小动脉ECs，促进血管重塑。因此，Flk1+ECs的功能障碍可能对肺小动脉的先进血管重塑发病机制起到贡献作用。
亮点：
Flk1和Flt1在肺内皮细胞中表达不同，Flk1+内皮细胞特异性地定位于小血管，包括小动脉，而Flt1在大到小血管中广泛表达。
在正常氧气条件下，内皮特异性Flk1缺失小鼠没有展现肺血管重塑或肺动脉高压，而Flk1缺失的内皮细胞变为立方形并突出进入肺动脉的腔内，伴随着相应的转录变化。
内皮Flk1缺失和缺氧协同作用，加剧内皮细胞功能障碍，促进中介质增厚和新内膜形成，并恶化肺动脉高压。
参考文献：
Akiyama T, Sadahiro T, Yamada Y, Fujita R, Abe Y, Nakano K, Honda S, Ema M, Kubota Y, Sakai S, Hizawa N, Ieda M. Flk1 Deficiency and Hypoxia Synergistically Promote Endothelial Dysfunction, Vascular Remodeling, and Pulmonary Hypertension. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Aug 3. doi: 10.1161/ATVBAHA.123.319266. Epub ahead of print. PMID: 37534464.
转自：“肺动脉高压研究进展”微信公众号
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