研究背景：
肺动脉高压（PH）的定义是平均肺动脉压（mPAP）的增加。PH是一种毁灭性的疾病，除了高死亡率外，还可能导致右心衰竭。PH根据其潜在原因被分类为5个组，包括肺动脉高压（PAH；组1）、左心病（组2）、肺部疾病或缺氧（组3）、慢性栓塞性肺动脉高压（组4）和其他类型（组5）。其中，PAH是一种严重的肺血管疾病，因血管平滑肌细胞和内皮细胞过度增生而致命。PAH是结缔组织疾病（CTDs）的严重并发症。此外，肺静脉闭塞病常与结缔组织疾病相关的PAH（CTD-PAH）有关，尤其是系统性硬化症患者。尽管由于血管舒张剂的发展，PAH的预后有所改善，但CTD-PAH的预后仍然不佳。其中一个原因是缺乏能够重现严重CTD-PAH患者病理生理的适当小鼠模型。
多种生长因子可能参与PAH的发展，包括血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白。此外，循环中的促炎性细胞因子，如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子，在PAH患者中升高。动物研究强烈支持细胞因子的贡献，特别是通过IL-6信号传导，在PAH的发病机制中起重要作用。这些细胞因子可以通过环境因素受到芳香烃受体的控制，芳香烃受体对PAH的发展至关重要。
免疫系统的固有免疫细胞，如巨噬细胞，对PAH的诱导也至关重要。人们普遍认为固有免疫细胞是产生促炎性细胞因子的主要细胞，其表达受到转录和转录后调节机制的严密调控。在转录后调控中，通过控制参与免疫反应的mRNA的翻译和降解，免疫反应得以介导。尽管表观遗传学、转录调节和微小RNA的参与已得到广泛研究，但在PAH中RNA结合蛋白的意义尚不明确。
Regnase-1（由ZC3H12A基因编码）是一种RNA结合蛋白，在固有免疫和获得性免疫细胞的转录后免疫调节中起关键作用。Regnase-1具有RNase结构域，能够通过识别其3'-非翻译区（3'-UTR）中的茎环结构降解参与免疫反应的mRNA，如Il6和Il1b。Regnase-1在翻译终止后通过螺旋酶UPF1启动mRNA降解。Regnase-1缺陷的小鼠会产生大量的促炎性细胞因子，包括IL-6，从而导致巨噬细胞中的严重自身免疫性炎症性疾病的发展。此外，在小鼠心肌细胞中缺乏Regnase-1会导致压力过载引起的心力衰竭。Regnase-1的表达与各种人类疾病，如溃疡性结肠炎和肺纤维化，有关。然而，Regnase-1是否参与PAH的发病机制还不清楚。
在这项研究中，研究发现患有PH的外周血单个核细胞（PBMC）中ZC3H12A的表达水平低于健康志愿者。此外，巨噬细胞中的Regnase-1缺乏的小鼠会自发地发展严重的PAH。
研究方法：
首先，研究检查了不同类型PH患者外周血单个核细胞中ZC3H12A（编码Regnase-1）的表达水平，寻找ZC3H12A表达与临床特征之间的关联。然后，研究构建了缺乏Regnase-1的巨噬细胞，包括肺泡巨噬细胞的小鼠，并检查了右心室收缩压和肺部的组织学变化。研究进一步对肺泡巨噬细胞和肺动脉的转录组进行了全面分析，以确定Regnase-1在肺泡巨噬细胞中调控的基因。
研究结果：
ZC3H12A在外周血单个核细胞中的表达与PH患者的预后和疾病严重程度呈负相关，尤其是在结缔组织病-PAH患者中表现得更为显著。
图1. 患有PH的患者中Regnase-1 mRNA的表达下降。
图2. 外周血单个核细胞中Regnase-1 mRNA表达与CTD-PAH的发病程度呈负相关。
肺泡巨噬细胞中Regnase-1的关键作用也得到了通过缺乏Regnase-1的小鼠分析的支持。这些小鼠自发地发展出严重的PAH，其特征为升高的右心室收缩压和不可逆的肺血管重塑，这复制了PAH患者的病理学。
图3. 缺乏肺泡巨噬细胞中Regnase-1的小鼠自发发展出严重的肺动脉高压。
图4. 肺泡巨噬细胞中Regnase-1的缺乏促进肺动脉高压的发展。
对这些PAH小鼠肺泡巨噬细胞和肺动脉进行的转录组分析揭示了Il6、Il1b和Pdgfa/b可能是Regnase-1在肺泡巨噬细胞中调节PAH的潜在靶点。通过抗IL-6受体抗体或Imatinib抑制血小板源性生长因子，而不是通过Anakinra抑制IL-1β，可以改善PAH的发病机制。
为了揭示在Regnase-1缺乏情况下，肺动脉重塑是如何由肺泡巨噬细胞诱导的，研究通过激光捕获显微切片（图5A）对CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠和对照小鼠的肺动脉进行了转录组学分析。如预期所示，基因集富集分析显示在CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠的肺动脉中上调的基因集中高度富含与细胞周期和细胞增殖相关的基因（图5B），与中膜壁增厚和浓密层状新内膜一致。此外，GO分析显示与免疫反应相关的生物过程在CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠的肺动脉中上调的基因中高度富集，相比之下，对照小鼠中这些基因中免疫反应相关的生物过程富集程度较低（图5C）。此外，KEGG通路分析显示在CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠的肺动脉中，细胞因子-细胞因子受体相互作用通路中的基因富集程度很高（图5D）。
图5. 肺泡巨噬细胞中Regnase-1缺乏与肺动脉之间的配体-靶标连接分析。
研究还分析了从CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠和对照小鼠中分选的肺泡巨噬细胞的转录组学变化（图5A）。肺泡巨噬细胞的转录组学分析显示了多种参与向M1和M2亚型的巨噬细胞激活的基因上调（图5E）。这些基因包括Il6、Nos2、Chil3、Arg1和Mrc1。此外，CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠的肺泡巨噬细胞中上调了多种生长因子和细胞因子（图5F）。
这些结果促使研究假设，Regnase-1缺乏的肺泡巨噬细胞分泌的因子可控制肺动脉细胞的增殖，从而诱导血管重塑。为了分析肺泡巨噬细胞与肺动脉之间的转录组学变化关系，研究使用了NicheNet进行数据分析。NicheNet是一种计算方法，通过结合肺泡巨噬细胞和肺动脉的转录组数据来预测配体-靶标之间的联系。分析识别出一组可能在Regnase-1缺乏巨噬细胞和肺动脉之间起作用的配体-靶标网络（图5G）。特别高排名的配体包括Il1b、Il1a、Tnfsf10、Il6、Vegfa、Pdgfb、Il33、Apoe、Anxa1和Ccl5（图5G）。这些来自Regnase-1缺乏的肺泡巨噬细胞的生长因子和细胞因子可能有助于肺动脉的病理性变化。
图6. Regnase-1通过降解Il6和Pdgf的mRNA保护免受肺动脉高压的进展。
接下来，研究分析了NicheNet鉴定的因子是否受Regnase-1介导的mRNA降解直接调控。由于Regnase-1识别目标mRNA的3'-UTR区域，研究构建了携带Il1a、Tnfsf10、Vegfa、Pdgfb、Il33、Apoe、Anxa1和Ccl5以及显著生长因子Pdgfa、Egf和Igf1的Luciferase报告基因的质粒。除了经过验证的Regnase-1靶点3'-UTR，Il6，野生型Regnase-1（Reg1 WT）的过表达显著抑制了HEK293T细胞中携带Il1a、Tnfsf10、Pdgfa、Pdgfb和Il33的3'-UTR的Luciferase活性，但对于Vegfa、Apoe、Anxa1、Ccl5、Egf或Igf1没有抑制作用（图6A）。相反，核酸酶活性缺失突变体Regnase-1（D141N）未能抑制任何被检测基因的报告基因活性（图6A），这表明Regnase-1作为核酸酶控制着这些新的靶标mRNA。因此，结果表明，不仅Il6和Il1b，而且Il1a、Il33、Tnfsf10、Pdgfa和Pdgfb也是肺泡巨噬细胞中Regnase-1的靶标，与PAH的发展密切相关。
接下来，研究探索了在Regnase-1缺乏的肺泡巨噬细胞中，哪些因素参与了PAH的发病机制。由于IL-6是与PAH发病密切相关的炎性细胞因子，并且受到Regnase-1的精细调控，首先通过给CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠注射抗IL-6R抗体MR16-1或对照IgG（图6B）来评估IL-6在PAH发病中的贡献。使用MR16-1阻断IL-6显著减轻了CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠的RVSP和RV/(LV+S)比率（图6C和6D），这表明Regnase-1介导的IL-6调控参与了疾病的发病过程。然而，组织学分析显示，虽然MR16-1治疗后CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠肺动脉的闭塞和严重重建的频率（grade 3）有所降低，但并未完全减轻（图6E-6G），这意味着除IL-6外，还有其他因素参与了PAH的发展。为了研究Regnase-1缺乏时PAH发病机制中不依赖于IL-6的机制，我们着重控制了IL-1和PDGF信号的控制，它们的mRNA直接受Regnase-1调控（图6A）。已知IL-1介导的反应可以通过体内IL-1受体拮抗剂（anakinra）治疗来抑制。此外，PDGF信号的抑制是通过imatinib实现的，它是抑制PDGF受体α和β的酪氨酸激酶抑制剂。然而，每日腹腔注射anakinra未能抑制RVSP，而每日口服imatinib显著降低了CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠的RVSP（图6H和6I）。尽管如此，RV/(LV+S)比率在对imatinib治疗的反应中并没有显著改变（图6J）。组织学上，在imatinib治疗的CD11c-Cre+Zc3h12afl/fl小鼠中，肺动脉闭塞率显著降低（图6K和6L）。此外，imatinib处理小鼠中严重重建动脉的减少现象也被观察到（图6M）。另一方面，anakinra治疗并未显著改善肺动脉的闭塞或重建（图6K-6M）。
研究结论：
Regnase-1通过调控肺泡巨噬细胞中的IL-6和血小板源性生长因子维持肺部的先天免疫稳态，从而抑制小鼠PAH的发展。此外，在不同类型PH中Regnase-1的表达降低意味着其参与PH的发病机制，可能作为一种疾病生物标志物，并且也是PH的治疗靶点。
在这项研究中，研究发现Regnase-1对PAH的发病至关重要。在患有PH的患者中，PBMCs中ZC3H12A的表达下降，并与CTD-PAH的严重程度呈负相关。在髓系细胞中缺乏Regnase-1的小鼠自发地发展出严重的PAH。研究在肺泡巨噬细胞中识别了一组可能促进PAH发病的Regnase-1靶向mRNA。其中，通过抑制IL-6和PDGF减轻了Regnase-1缺乏肺泡巨噬细胞导致的PAH。综上所述，Regnase-1通过降解肺泡巨噬细胞中的Il6和Pdgfa/b等mRNA来预防PAH的发展。
目前鼠标中很少有能够模拟患有严重PAH患者中观察到的内膜细胞增殖和复杂的丛样病变的严重PAH模型，除了影响缺氧/缺氧应答途径的模型。虽然Sugen5416/缺氧处理是一种广泛用于大鼠的严重PAH动物模型，但是用Sugen5416/缺氧处理的小鼠表现出媒介肌层肌化而不是严重的内膜细胞增殖。而且，据报道内皮细胞特异性prolyl-4 hydroxylase 2缺失的小鼠通过缺氧诱导因子-2α表现出严重的PAH。小鼠的血吸虫相关PAH模型也会导致严重的炎症性PAH，但该疾病在小鼠中并不致命，且血吸虫病可以得到解决。而通过使用CD11c-Cre或LysMCre小鼠在髓系细胞中缺乏Regnase-1，这些小鼠在正常缺氧条件下自发发展出不可逆的PAH，伴有浓密的内膜壁增厚和复杂的丛样病变。此外，这些小鼠还出现了肺静脉闭塞病和心脏纤维化，这些通常与CTD-PAH相关。据目前所知，这些小鼠是一种新的小鼠模型，与现有的小鼠模型相比，更好地重现了患有严重CTD-PAH的患者的病理生理学。
有何临床意义？
● Regnase-1的表达可能作为肺动脉高压的疾病生物标志物。
● 这项研究为开发针对严重结缔组织病相关PAH的治疗方法提供了独特的小鼠模型。
● 通过抑制一系列细胞因子和生长因子，Regnase-1可能成为治疗PAH的治疗靶点。
参考文献：
Yaku A, Inagaki T, Asano R, Okazawa M, Mori H, Sato A, Hia F, Masaki T, Manabe Y, Ishibashi T, Vandenbon A, Nakatsuka Y, Akaki K, Yoshinaga M, Uehata T, Mino T, Morita S, Ishibashi-Ueda H, Morinobu A, Tsujimura T, Ogo T, Nakaoka Y, Takeuchi O. Regnase-1 Prevents Pulmonary Arterial Hypertension Through mRNA Degradation of Interleukin-6 and Platelet-Derived Growth Factor in Alveolar Macrophages. Circulation. 2022 Sep 27;146(13):1006-1022. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.122.059435. Epub 2022 Aug 23. Erratum in: Circulation. 2022 Nov 8;146(19):e280. PMID: 35997026.
转自：“肺动脉高压研究进展”微信公众号
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