Cell：畅磊福团队解析I-B型CRISPR系统引导Tn7样转座子的分子机制

CRISPR关联的转座子（CRISPR-associated transposons，CASTs）是一类能借助CRISPR系统实现定向移动的转座子。CASTs具有RNA引导的程序性基因编辑特性，并可以在不暴露DNA双链断裂位点的情况下实现大片段DNA在基因组特定位点的精确插入。这在生物医学研究和遗传疾病的治疗方面具有极大的潜力。

CASTs主要为Tn7-like转座子，它们在独立的进化事件中获取了不同的CRISPR系统，例如V-K型、I-F型和I-B型等。虽然这些CRISPR系统都可以引导Tn7-like转座子，但它们的分子机制可能存在差异。深入研究这些差异有助于进一步理解并开发这些系统。近年来，科研人员对蓝藻Scytonema hofmanni(ShCAST)中的V-K类型【5-11】和霍乱弧菌Vibrio cholerae(VchCAST)中的I-F类型有了较为广泛的研究。然而， I-B型CRISPR系统如何引导Tn7-like转座子尚不清楚。

2023年8月8日，美国普渡大学畅磊福研究团队在 Cell 期刊发表了题为：Molecular mechanism for Tn7-like transposon recruitment by a type I-B CRISPR effector 的研究论文。

为了解析I-B型CRISPR系统引导Tn7-like转座子的分子机理，该团队使用冷冻电镜结合生化分析的方法，对一种来自地衣中的蓝细菌共生体Peltigera membranacea cyanobiont 210A的CAST系统（PmcCAST）进行了系统研究。该研究揭示了I-B型CRISPR效应复合物（Cascade）如何在目标DNA结合时招募特定的转座蛋白，包括TniQ和TnsC七聚体。这些发现强调了CRISPR效应复合物引导Tn7-like转座子机制的多样化，这将有助于开发CASTs进行精准的基因编辑应用。

该研究的主要发现如下：

1）PmcCAST的生化重组和Cas11的发现。作者首先通过生化方法重组了PmcCAST，并意外发现小蛋白Cas11参与了Cascade的组装（图1）。他们还发现TnsB的转座酶活性是转座所必需的，但TnsA却不是。当TnsA失去活性时，转座主要以共整合的形式发生，这与原型Tn7类似。

图1. Type I-B PmcCAST系统的基因结构（A）和工作模型（B）

2）PmcCascade–DNA–TniQ–TnsC复合物的结构解析。作者使用cryo-EM分析了PmcCascade–DNA–TniQ–TnsC复合物的结构（图2），揭示了底物DNA的识别引起的Cascade构象变化。一系列结构和生化实验结果显示，引导RNA与底物 DNA碱基配对超过了特定位置时（第23个碱基对），Cas6会发生显著的构象变化，使TniQ的结合位点充分暴露，从而激活RNA引导的转座活性。

图2. PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC复合体的cryo-EM结构（A，B）和引导RNA- 底物DNA示意图（C）

3）TniQ与PmcCascade的结合机制。TniQ的C端结构域通过两个结合位点与PmcCascade相互作用。第一个结合位点位于Cas6和Cas7.1的交界处，通过氢键和疏水作用连接；第二个结合位点位于Cas11上，通过疏水相互作用结合。

4）TniQ与TnsC七聚体的结合机制。作者随后分析了TniQ的N端结构域与AAA+ ATP 酶TnsC的相互作用，并从结构的角度解释了只有一个TniQ能与TnsC七聚体结合的原因。

5）PmcCAST组分识别底物DNA的结构基础。结构还阐明了PmcCascade，TniQ和TnsC如何与底物DNA相互作用，范围从PAM序列到接近插入位点。值得注意的是，PAM远端的DNA由于TniQ和TnsC七聚体的结合发生了约50°的弯曲。结果还显示TnsC的C端柔性区域可能参与招募TnsAB转座酶以实现DNA插入。

总的来说，该研究推进了我们对RNA引导的DNA转座系统的结构和机制的理解，可以促进将CASTs开发为精确DNA插入工具的研究进展。最近，V-K 型和I-F 型CASTs在哺乳动物细胞中的成功应用，标志着CASTs在基因编辑应用中的重要进展。需要指出的是，CAST的研究和开发还在进行中，还有许多挑战需要解决，比如编辑效率和递送方法的优化。我们期待在不久的将来可以看到该应用的进一步发展。

普渡大学副教授畅磊福为论文通讯作者，博士生王淑堃为论文第一作者。博士生Clinton Gabel和Romana Siddique以及Thomas Klose博士参与了研究工作。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.07.010

转自：“生物世界”微信公众号

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