The Plant Cell | 可视化植物钙传感激酶构象，实时解码植物Ca2+信号

胞质钙离子(Ca2+)浓度的变化是对多种胁迫信号的最早反应之一，然而过多的Ca2+可渗透通道可能产生不同的Ca2+信号和对胁迫的特异性响应。CDPKs是Ca2+传感器激酶，CDPKs能够直接结合Ca2+并将Ca2+信号传递到蛋白质磷酸化中，Ca2+解码可以被认为是一个连续的三个反应过程:(i)通过Ca2+与EF-hand基序结合感知Ca2+， (ii)诱导的构象变化(CDPK激活所需)，(iii)其接力到目标蛋白磷酸化(CDPK活性)的响应输出，但是目前Ca2+信号的解码机制尚不清楚。

近日，Anja Liese等在国际知名期刊《The Plant Cell》上在线发表一篇题为：“Imaging of plant calcium-sensor kinase conformation monitors real time calcium-dependent decoding in planta”的研究论文，该研究开发了一种基于Förster共振能量转移(FRET)的基因编码报告器，可以可视化钙依赖性蛋白激酶(CDPKs/CPKs)的构象变化，是在多种植物发育和胁迫反应中实时解码Ca2+信号的强大方法。

首先该研究设计了一个基于FRET的CDPK报告因子，来记录Ca2+诱导的CDPKs构象变化。研究选取了两个不同Ca2+敏感性的CDPKs（高Ca2+敏感性的拟南芥AtCPK21和对Ca2+不敏感的AtCPK23）作为研究对象，与CPK23相比，CDPK-FRET构象变化测量准确报告了CPK21对Ca2+敏感性的异构体特异性差异（图1）。

图1.CDPK-FRET报告了CDPKs构象改变的异构体特异性Ca2+依赖性。

CDPKs的特点是它们的异构体特异性和各自激酶活性高度可变的Ca2+依赖性。为了进一步评估CDPK-FRET的能力和分辨率，研究使用CDPK-FRET报告器来分析CPK21和CPK23对Ca2+敏感性的分子基础，发现一个单一的CPK23自磷酸化位点Ser362是修饰Ca2+敏感性和改变催化活性的关键。此外，研究还通过激活步骤(Ca2+结合依赖的构象变化)作为分子读数，验证了CDPK-FRET作为评估CDPKs生化特性的强大工具（图2）。

图2.假底物段中一个独特的自磷酸化位点控制CDPKs的构象变化和激酶活性对Ca2+的依赖性

接下来，研究在植物细胞Ca2+浓度变化的环境中使用CDPK-FRET，发现烟草花粉管中Ca2+的时空波动是协调的，CPK23-FRET不能监测任何尖端聚焦的振荡胞浆Ca2+浓度模式，CPK21-FRET在相期内捕获了花粉中振荡的Ca2+浓度模式，且没有显著的时间延迟，从而表明它是一个快速准确的Ca2+变化报告器（图3）。

图3.烟草花粉管顶端聚焦的Ca2+振荡被CPK21-FRET实时解码，而CPK23-FRET无法实时解码

保卫细胞对ABA或flg22的应用做出反应，通常会引起细胞质Ca2+的变化，这些变化通过不同的Ca2+传感器激酶传递到阴离子通道，从而启动气孔关闭。为了测试CPK21是否在响应一种或两种刺激时被生物化学激活，研究将 ABA或 flg22涂抹在拟南芥表皮皮上后，选择单个守卫细胞进行延时成像，同时记录CPK21-FRET和R-GECO1信号，发现这两种刺激都以R-GECO1信号重复瞬态的形式诱导细胞质Ca2+浓度的增加，引起了CPK21的构象变化（图4）。在保卫细胞的生物环境中，ABA-和flg22诱导的Ca2+浓度变化和CPK21构象变化动力学之间的差异是明显的，表明刺激依赖于Ca2+信号解码（图5）。

图4.ABA-和flg22诱导的拟南芥保卫细胞Ca2+浓度的变化诱导了CPK21-FRET的实时构象激活。

图5.ABA-和flg22诱导的CPK21构象变化信号在时间、同步、强度和形状上存在差异，表明刺激依赖于Ca2+信号解码。

文章链接：

https://doi.org/10.1093/plcell/koad196

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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