CTM | 唐诗聪/陈凯/刘德权/杨日荣/单细胞分辨率下的B细胞异质性和三级淋巴结构

肿瘤微环境内的免疫细胞在肿瘤的发展和治疗中都起着关键作用，已知这些肿瘤浸润性免疫细胞可能具有拮抗或促进肿瘤的功能，其中，B细胞通过生发中心反应在肿瘤免疫中起关键作用，尤其是聚集形成三级淋巴结构 (Tertiary lymphoid structure，TLS)时。研究表明，在大多数实体瘤中，TLS的存在与良好的免疫治疗反应和临床预后密切相关，这引起了人们的极大关注。单细胞测序技术，这一场革命彻底改变了我们对肿瘤的认识，对肿瘤的细胞组成拥有了更广泛的见解，但通过单细胞视角，基于TLS的表达情况，去探索肿瘤微环境，这种极具创新的见解还未有人报道。

2023年8月1日，昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）唐诗聪、刘德权，昆明理工大学陈凯及广西医科大学杨日荣共同通讯在Clinical and Translational Medicine（IF=11）在线发表题为“Single-cell transcriptome sequencing of B-cell heterogeneity and tertiary lymphoid structure predicts breast cancer prognosis and neoadjuvant therapy efficacy”的研究论文，该研究基于单细胞水平和临床水平，剖析了B细胞和TLS在抗肿瘤免疫中发挥的重要作用，同时，还提供了一种简便易行的标志物CD23来鉴别TLS，并发现TLS及其标志物与乳腺癌的良好预后显著相关。这些发现都将为肿瘤的个体化精准治疗提供更多有价值的线索。

乳腺癌是一种异质性很强的疾病，虽然，近年来免疫治疗提高了患者在各种实体或血液系统恶性肿瘤中的存活率，但大多数乳腺癌亚型对免疫检查点阻断治疗几乎没有反应。B细胞在抗肿瘤免疫中起重要作用，特别是在TLS中聚集时。然而，单细胞分辨率下的B细胞异质性和三级淋巴结构在乳腺癌中的临床意义有待进一步探索。

对8774个TIL-B进行亚分类和功能富集，可分为5个簇：CXCR4+ B 细胞（B0）、生发中心B细胞（B1）、滤泡B细胞（B2）、浆细胞（B3）和幼稚B细胞（B4）。作者意外地发现浆细胞中免疫球蛋白重链和轻链基因存在互斥表达。浆细胞和类别转换B细胞有相同的表现：重链基因IGHG、IGHA和轻链基因IGLC、IGKC存在相互排斥的差异表达。这表明在乳腺癌中存在潜在TLS并发生局部持续类别转换重组。

接下来，该研究开始探讨TIL-B与TLS的关系，为了验证上述推测，作者使用来自TCGA乳腺癌队列的H&E染色组织切片进行分析，以评估TLS的存在情况，CD23最近被报道是滤泡树突状细胞（Follicular dendritic cell，FDC）的标志物，并且FDC上CD23的表达不依赖于肿瘤的CD23过表达。该研究通过IF发现CD23与FDC标记物CD21共定位，此外，还有研究报道CD23也表达于成熟TLS中，基于此，作者大胆推测，CD23或许是BC中成熟TLS的潜在生物标志物，并对其进行了验证。通过对随机抽取的70例BC患者进行H&E和CD23的IHC染色，研究发现，通过H&E染色筛查到的每张切片中的成熟TLS数量明显低于通过CD23 IHC染色筛查到的成熟TLS数量（1.3 : 2.1），并且这两种方法之间的一致性适中（组内系数 0.75，95%CI 0.63-0.84；kappa 0.75，SE 0.089）。

评估已进行过单细胞测序的14名患者的TLS情况，由于现实因素，经评估后，将3名BC患者纳入TLS阳性组，其余6名为TLS阴性组。接着，作者进行了两组中的成纤维细胞和免疫细胞间的CellphonDB和Cellchat分析比较，发现TLS阴性患者存在潜在的免疫性抑制微环境。

在研究中发现了一个有趣的现象：TLS阴性组中的TAN的BAFF和 TNF水平相对较高，但由于该研究中的数据集样本量较小，因此使用了反卷积算法CIBERSORTx来模拟细胞类型特异性基因表达谱并预测大规模scRNA-seq 数据集中每种细胞类型的丰度。结果表明，与TLS-high组相比，TLS-low组中的TAN和TIL-B具有显著的正相关性，此外，还发现与TLS阳性组相比，TLS阴性组具有更高水平的炎症信号通路、PD-1检查点通路等，所有这些通路都与更具侵袭性和难治性的癌症有关。

通过使用scMetabolism包对代谢途径进行评分，并在单细胞水平上分析两组免疫细胞的基因表达。令人惊讶的是，TLS阳性组和TLS阴性组间的免疫细胞具有完全不同的代谢途径。在TLS阴性组中，三羧酸循环（TCA循环）、糖酵解和脂肪酸产生均显著上调，并且这些代谢途径的激活被认为与癌发生、进展和耐药性密切相关。

此外，作者还在两名对新辅助免疫治疗和新辅助化疗有显著效果的BC患者的肿瘤组织中发现了TLS表达，反之，在治疗反应较差的乳腺癌患者中，并未发现TLS的存在。为了对这一发现进行验证，作者基于12 genes法将三个独立队列（GSE35640；GSE25055；IMvigor210）分为两组：CD23+TLS_low和 CD23+TLS_high，并比较他们对新辅助化疗和免疫治疗的反应。在新辅助化疗BC 队列中，发现CD23+ TLS _high 患者表现出明显的化疗敏感性。同时，免疫治疗黑色素瘤队列中CD23+TLS _high的患者表现出显著的ICB敏感性。此外，尽管IMvigor210队列中高组和低组之间的免疫治疗反应没有显著差异，但CD23+TLS_high组具有更好的临床预后。

该研究表明，基于scRNA-seq证明了TME中的各类细胞在TLS的不同状态下，会呈现出明显的细胞间通讯和代谢异质性，并存在显著生存差异，成熟TLS的存在与更好的化疗疗效或免疫治疗反应相关。此外，使用CD23作为成熟TLS的免疫组织化学标记物，在13%的乳腺癌患者中发现了TLS，并且与临床病理特征和分子分型无关。

昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）唐诗聪教授、刘德权教授，昆明理工大学陈凯教授及广西医科大学杨日荣教授是该论文的共同通讯，昆明医科大学第三附属医院（云南省肿瘤医院）硕士研究生王青、博士研究生刘睿以及昆明理工大学博士研究生孙珂是论文的共同第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/ctm2.1346

转自：“iNature”微信公众号

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