高效模拟过氧化物酶的单原子纳米酶维度工程

1、文献题目

Dimensionality Engineering of Single-Atom Nanozyme for Efficient Peroxidase-Mimicking

文献期刊：J. Am. Chem. Soc.

10.1021/jacs.3c05162

2、文献提出的科学问题

单原子纳米酶(SAzymes)是一类活性位点与天然金属酶相似的新型纳米酶，目前SAzymes的催化中心是二维(2D)结构，缺乏协同底物结合特征限制了它们的催化活性。

3、分解为几个研究目标

1、通过简单的热解已FeCl3、三聚氰胺和L-半胱氨酸分别用作铁、氮和硫的来源路线制备FeN4C-SOx酶。

2、FeN4C SOx和FeN4C SAzymes的POD活性通过在H2O2存在下催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的氧化来表征。

3、通过密度泛函理论(DFT)计算探讨了FeN4C和FeN4C - SOx SAzymes催化的H2O2分解反应。

4、研究总体方案

通过一种维度工程策略，通过将氧化硫官能团整合到碳平面上，将传统的2D Fe-N-4中心转化为3D结构，氧化硫官能团可以作为结合位点，帮助底物定向和促进H2O的解吸。

5、方法和技术手段

SEM、TEM、XPS、ICP-OES、BET、同步辐射、DFT

6、主要研究成果

1、FeN4C-SOx酶通过简单的热解路线制备，其中FeCl3、三聚氰胺和L-半胱氨酸分别用作铁、氮和硫的来源。FeN4C-SOx和FeN4C SAzymes分别通过添加15和30mg FeCl 3来制备。ICP-OES测定FeN4C-SOx和FeN4C SAzymes的确切Fe含量分别为0.99和1.03 wt %。TEM图像显示FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes具有二维形态，没有可识别的金属纳米颗粒。FeN4C−SOx SAzyme的元素映射图显示，C、N、S、O和Fe均匀分布在碳载体上。同样，C、N、O和Fe在FeN4C SAzyme的碳底物中也很好地分散。FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes的x射线衍射图显示只有两个宽峰，这归因于石墨碳的(002)和(101)晶面。FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes的拉曼光谱显示出两个以1350和1580 cm−1为中心的主峰，分别对应于D-和G-波段。这些结果证实了在FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes中没有形成结晶金属。AC-HAADFSTEM图像中可以识别出明亮和孤立的金属原子，证实了单个铁原子在FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes上的原子分散。FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes具有相当大的Brunauer - Emmett - Teller比表面积(FeN4C−SOx: 341 m2 g−1;FeN4C: 411 m2 g−1)和孔径分布。FeN4C−SOx SAzyme的x射线吸收近边结构(XANES)谱与Fe2O3的x射线吸收近边结构(XANES)谱接近，证明Fe位的价态约为+3。FeN4C−SOx SAzymes和FePc的傅里叶变换扩展x射线吸收精细结构(FT-EXAFS)光谱拟合与Fe−N键在1.5 Å处相吻合，在标准Fe箔和FeS2对照中没有观察到Fe−Fe/Fe−S键这些信号。量化的EXAFS曲线拟合分析表明，最佳拟合结果清楚地表明FeN4C−SOx SAzyme具有Fe−N-4结构。FeN4C−SOx SAzymes的配位数为4,Fe−N长度为2.0 Å。FeN4C - SOx SAzyme和FePc的小波变换(WT)−EXAFS等值线图显示出相似的R和k值。显然，FeN4C - SOx SAzyme与传统FeN4C SAzyme一样具有典型的Fe - N-4活性位点。

2、Fe 2p3/2的XPS光谱显示结合能接近Fe2O3的结合能，表明Fe离子在FeN4C SOx和Fe NC SAzymes中的氧化态均为+3，与Fe K边XANES光谱的结果一致。除了S 2p，类似的峰和元素组成出现在C 1s、N 1s和O 1s的高分辨率XPS光谱中，表明FeN4C SOx和Fe NC SAzymes含有大量相同的组成和结构。如FeN4C SOx SAzyme的高分辨率S 2p峰所示，167.6 eV和167.6 eV处的峰可分别归因于C-S-物种和氧化的S部分C-SOx-C。值得注意的是，C-S-C和C-SOx-C物种的数量相当(图S9)，这将对碳平面中的π电子带产生吸电子效应因此，如果SOx官能团位于Fe原子附近，Fe3+在Fe-N-4位置的电子自旋构型可能会受到影响。为了证实这一假设，测量了FeN4C SOx和FeN4C SAzymes的零场冷却温度依赖性磁化率。FeN4C SOx和FeN4C SAzymes的有效磁矩分别计算为3.33和3.84 μeff。−C−SOx−C−的掺入降低了高自旋Fe3+的比例，表明一些高自旋Fe3+离子转移到了低自旋态。FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes的未配对电子数(n)分别为2.5和3。这些结果表明，−C−SOx−C−部分位于Fe−N-4位点附近。

3、FeN4C SOx和FeN4C SAzymes的POD活性通过在H2O2存在下催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的氧化来表征。吸收光谱显示了典型的显色反应，其中酶在H2O2存在下将TMB底物氧化成其相应的氧化产物。与大多数报道的具有POD-样活性的纳米酶相似，FeN4C SOx和FeN4C SAzymes在酸性条件下表现出更高的催化性能。因此，在pH值为3.6时，研究了FeN4C SOx和FeN4C SAzymes的比活性和动力学参数。FeN4C SOx SAzymes的比活性为119.77 U/mg，比FeN4C SAzymes (17.44 U/mg)高6.8倍。在合适的H2O2和TMB浓度范围内，获得了FeN4C (0.30 μg/mL)和FeN4C SOx(0.06μg/mL)SAzymes的典型米氏曲线。FeN4C SOx对H2O2和TMB的Km值为39.55和0.32 mM，FeN4C SOx酶对H2O2和TMB的Kcat值为4.37和7.21S-1。FeN4C SOx SAzyme表现出比FeN4C SAzyme更高的Kcat。与其他铁酶相比，FeN4C SOx酶表现出竞争性催化活性。适当提高反应温度可以进一步提高反应速率，FeN4C SOx和FeN4C SAzymes可以在很宽的温度和pH范围内保持稳定性。FeN4C−SOx和FeN4C SAzymes的POD活性在储存一年后仍保持在90%左右。添加KF后可以完全抑制POD活性，表明Fe−N4位点是催化位点。利用电子顺磁共振波谱法对反应机理进行了探讨。验证了羟基自由基(•OH)的生成，证实了•OH是活性中间体。FeN4C−SOx SAzyme对•OH的信号强度高于FeN4C SAzyme，表明FeN4C−SOx SAzyme具有更好的催化活性。

4、为了深入了解FeN4C - SOx SAzymes催化效率提高的原因，通过密度泛函理论(DFT)计算探讨了FeN4C和FeN4C - SOx SAzymes催化的H2O2分解反应。有两种稳定的SOx取代构型，即FeN4C−SOx-side和FeN4C−SOx-center，其中- SOx取代物分别位于侧C原子和中心C原子上。计算结果表明，FeN4C−SOx侧比FeN4C−SOx中心更稳定(0 vs 2.45 kcal/mol)。因此，FeN4C−SOx侧被认为是主要的配位模式。进一步分析了FeN4C、FeN4C−sox - side和FeN4C−SOx-center催化H2O2分解反应的模拟pod反应途径和Gibbs自由能谱。发现了催化H2O2反应的类似机理。对于FeN4C，H2O2最初吸附在Fe位点的顶部。H2O2在Fe位点上的吸附在热力学上有利于FeN4C，具有0.38 eV的中等吸附能，随后H2O2分解。对于FeN4C SOx侧和FeN4C SOx中心，SOx的存在削弱了Fe位点和H2O2之间的吸附，这与动力学测试结果一致。H2O2在Fe位点被非均相切割，产生H2O分子和Fe=O物种[*(O + H2O)]，这与先前的报道一致。对于FeN4C催化的情况，也观察到H2O2均裂，其产生吸附在FeN4C的Fe位点上的两个*OH自由基。就能量而言，异源裂解途径比溶血途径更有利(1.59 eV对0.99 eV)。下一步，*(O + H2O)质子化成*(OH + H2O)。立即发生H2O离去，产生游离的H2O和吸附在Fe位点上的羟基(*OH)。*OH物质进一步质子化，形成吸附在Fe位点的H2O(* H2O)。最后，整个催化反应随着H2O的去除和Fe位的再生而完成。对于FeN4C，速率决定步骤是最后一步(H2O离去步骤)，并且计算的能垒适中(0.42 eV)，表明FeN4C催化反应可以在室温下以相对低的速率进行。然而，FeN4C SOx side和FeN4C SOx-center的速率决定步骤是H2O2吸附步骤，其能垒分别为0.21和0.12 eV，表明FeN4C SOx-center有利于H2O2分解反应。与FeN4C相比，FeN4C中的SOx显著降低了能垒，有利于产物分离。这一结果与我们的实验观察一致，即SOx取代的FeN4C SAzymes显示出更高的H2O2分解活性。

5、高毒性羟基自由基可以通过氧化细胞成分诱导细菌程序性细胞死亡。在这项研究中，细菌的消除能力用FeN4C−SOx SAzymes在H2O2存在下进行了研究。采用生长抑制法和平板计数法对FeN4C−SOx SAzymes的抑菌活性进行评价。首先在LB培养基中测定不同浓度H2O2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，测定其在600 nm处的OD值。结果表明，过氧化氢在较高浓度下具有较强的抗菌活性。在接下来的实验中，大肠杆菌(1mm H2O2)和金黄色葡萄球菌(0.1 mM H2O2)分别选择了合适的H2O2浓度。平板计数结果显示，在H2O2存在下，FeN4C−SOx SAzymes能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，表明FeN4C−SOx SAzymes具有POD活性，这是其具有良好抗菌活性的原因之一。

7、作者给出结论

1、利用维数工程设计了一种新颖高效的单原子纳米酶。我们发现，通过SOx取代，传统的2D Fe−N-4催化中心的维数增加显著提高了催化活性。

2、DFT模拟表明，在催化过程中，硫官能团的作用类似于天然HRP中远端血红素袋残基的作用，包括H2O2取向和H2O离开。

3、FeN4C−SOx SAzymes有效地消除了细菌。我们的合成策略为具有先进结构的单原子纳米酶的设计提供了新的见解，特别是在模仿天然酶的催化口袋的3D结构方面，有利于开发高性能的人工酶，用于各种实际应用，包括生物传感，癌症治疗和伤口愈合。

转自：“科研一席话”微信公众号

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