疑问:
查询APOE抗体的时候,发现同时出现APOE Polyclonal antibody和APOE Monoclonal antibody两个产品信息,这两个抗体代表什么意思?有什么区别?
生物医学领域的研究离不开抗体,WB、IP、IHC、IF、ChIP、FC等实验都需要用到抗体。从制备上来说,主要分为单克隆抗体和多克降抗体两大类。因其制备方式和来源不同,使得其在生产成本、性质和应用方面有着极大的差别。
定义上的区别:
机体受抗原刺激后,由淋巴系统的细胞(主要是B淋巴细胞分化后的浆细胞)产生具有特异性免疫功能球蛋白,即抗体。
克隆:指无性繁殖,即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系,该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb):是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。
多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb):顾名思义,由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混在一起就是多克隆抗体。简言之,多克隆抗体就是用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物,刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体的混合物。
制备方式上的区别:
抗体的制备,无论是单克隆抗体还是多克隆抗体,动物的前期免疫步骤是完全相同,差别在筛选这一步。
多克隆抗体由抗原免疫动物后,从动物的血清中纯化获得。
单克隆抗体由抗原免疫动物后,将动物的淋巴细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞融合,筛选出单克隆的杂交瘤细胞,通过ELISA筛选出能产高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞,通过培养单克隆杂交瘤细胞即可生产与抗原特异性结合的单克隆抗体。
性质上的区别:
特异性
多克隆抗体犹如许多单克隆抗体的集合,它们有的特异性高,有的特异性低,总体特异性符合正态分布曲线的形式,而其特异性的总体表现也应处于统计学正态曲线中位线(MID)的水平。而单抗制备后续的筛选过程,可去除大部分的非特异抗体,保留几株特异性较好的单克隆抗体。
一般而言,单克隆抗体具有更高的特异性。
多抗特异性可通过生产环节比如使用高纯度的免疫原,以及使用提纯的靶点蛋白对多抗进行免疫亲和层析纯化等方法得以改进。经过免疫亲和层析的多抗其总体特异性将大大提升,与单抗相比已相差无几。
交叉反应
抗原与抗体结合的特异性,是指某一抗原表位与相应抗体结合的特异性。这种结合的分子机制是抗原表位的空间结构与抗体分子超变区互补的结果。而交叉反应是指两种抗原分子表面存在有相同或相似的抗原表位时,与同一种抗体结合的现象。因此,交叉反应实质上也是抗原与抗体的特异性结合。
单克隆抗体仅针对目标抗原某一特定抗原表位,特异性高,存在有相同或相似的抗原表位几率低,出现交叉反应的几率也就低。
多克隆抗体针对目标抗原多个抗原表位,特异性低,具有生物物理多样性,存在有相同或相似的抗原表位几率高,出现交叉反应的几率也就较高。
假阳性
根据抗体最核心的表位结合区域—互补决定区(Complementarity Determining Region,CDR)的结构,抗体通常可以紧密结合的抗原表面区域或表位面积很小,对于变性的肽段约在4-8个Aa以内,以及5-7个单糖的糖链或6-8个核苷酸的核酸。通过肽段BLAST可以得知,小肽段序列完全相同的情况将在很多不同蛋白上发生。这意味着单抗识别的这个表位可能并不仅仅属于靶标蛋白本身,也即意味着,即使利用纯化抗原蛋白进行了特异性筛选的单克隆抗体,当用其检测复杂样本时,也将面临交叉反应或假阳性问题。
灵敏度
特异性决定了假阳性结果的多少,敏感性决定了检出率的高低。在复杂样本中,由于多克隆抗体识别抗原的多个表位,可以在一个抗原分子上结合更多的抗体分子,也可以在当部分抗原表位受到一定程度的遮盖或破坏时,仍有抗体结合在未受影响的表位上。这种情况常发生在如石蜡包埋的免疫组化(IHC-P)等实验中,当样本经甲醛交联固定后,即使经过抗原修复,抗原表位也不可避免地受到了影响,此时单克隆抗体由于只识别一个表位,结合能力可能大大降低甚至呈现阴性结果,而只要不是所有表位都受到了破坏,多抗仍可以获得该靶点的阳性结果。同样的,对于样本中一些表达丰度极低的蛋白,由于多表位结合更多抗体分子,检测信号就将被放大。因此,使用多抗具有灵敏度和检出率上的优势。
如何选择抗体:
1、结合实验需求选择
确定实验所用样本的种属:如human、rat、mouse、pig、goat等,选择物种相同或有交叉反应的抗体。有些稀有种属难以找到抗体,可通过蛋白的序列比对,尝试同源序列的一抗并在实验前进行预实验。
确定实验类型:抗体在很多生化实验中都有应用,不同的实验对抗体的特性与质量要求也不尽相同。实验之前,首先需要确定实验类型,如WB、IHC、IP、ELISA、FC等。
多抗/单抗选择:多克隆抗体与靶蛋白的多个抗原表位具有亲和力,信号可能更强,但也更容易发生交叉反应并产生非特异性信号。单克隆抗体仅对某一特定抗原表位具有亲和力,具有更高特异性,但灵敏度或强度较低,比多抗更难耐受化学处理导致的抗原表位丧失。
通过完全了解实验需求,结合特异性、种属、实验方法、标记物特性等一项一项地进行对比和挑选,最终选出合适的抗体。
2、参考文献
现阶段而言,大部分的实验都可以从相关文献中找到相同或类似的方法,所以,在进行实验的时候,可以适当地参考相关文献,进而选择合适的抗体。
3、查看抗体公司的验证结果:
几乎所有的抗体公司官网均会对特定抗体的特定应用(Application)进行验证,只有经过特定实验证实确定有效的应用才会出现在官网的抗体信息栏,并会把相关实验结果及实验条件等展示在相关抗体网页。通过对比实验条件和实验结果,很容易判断相关抗体的质量。常用的抗体公司,包括CST、Abcam、R&D System、Thermo Fisher、Proteintech等官网的相关信息基本真实。
4、查看抗体的引用文献:
查询抗体的时候,注意查看抗体的引用文献,对选择抗体具有很大的参考意义。大多数抗体公司都会将抗体的引用文献(甚至全文链接)展示在抗体网页方便客户查看。
5、查看第三方抗体评价网站;
这类网站根据既往SCI文章发表情况,统计、对比来自不同公司的同一抗体的应用情况,有的网站还会展示SCI论文中实验结果(图片)。这类网站包括https://www.biocompare.com,https://www.benchsci.com,https://www.citeab.com,https://www.deepbiogroup.com等。
题外:
综上,单克隆抗体和多克隆抗体的区别
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