Nature子刊：张楹/殷昊团队开发非病毒递送CAR-T构建新方法

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法，是一种精准靶向肿瘤的细胞治疗，在多种癌症治疗中均取得显著性疗效，为恶性肿瘤患者带来了希望。目前，已有多种构建CAR-T的递送方法，比如临床上常见的慢病毒递送或逆转录病毒递送等。然而，由于病毒载体随机嵌入基因组位点，导致CAR的表达量受嵌入位点的影响，无法稳定且均一地表达，极大影响抗肿瘤活性。此外，病毒载体随机整合基因组存在致癌风险。

近年来，非病毒递送CRISPR/Cas9构建CAR-T细胞受到广泛关注，直接利用电转递送编码CAR的DNA被证明是可行的，它能够同时实现定点整合CAR和调控内源性基因，避免了随机插入和病毒相关风险。另外，非病毒递送构建CAR-T工艺简单，适合于大规模生产，可极大降低了生产成本。但是递送效率低和高细胞毒性限制了其临床应用。

2023年7月27日，武汉大学医学研究院/教育部免疫与代谢前沿科学中心张楹/殷昊教授团队合作在 Nature 子刊 Nature Biomedical Engineering 上发表了题为：Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS-STING pathway 的研究论文。

该研究发现，cGAS-STING介导的天然免疫通路在电转双链DNA（dsDNA）诱导原代T细胞死亡中起着至关重要的作用，并揭示电转缓冲液的渗透压能够直接调节cGAS-DNA结合亲和力，进而影响cGAS-STING激活。利用等渗电转缓冲液可极大降低该通路的激活和细胞死亡，制备的CAR-T细胞数比商业电转多达20倍；相较于慢病毒构建的CAR-T, 编辑效率和表达量均提高3倍，杀肿瘤活力更高。

该研究开发了一种准确、高效且安全的递送方法用于构建更有效的CAR-T细胞，为调控cGAS-STING通路的激活打开了新思路，为非病毒递送构建CAR-T的临床转化研究奠定了基础。

研究团队首先探究了不同类型DNA对T细胞内cGAS-STING激活的影响,包括质粒、线性长双链DNA、线性长单链DNA，短双链DNA和短单链DNA。结果显示，只有当电转质粒和线性长双链DNA时，T细胞的活力明显降低，cGAS-STING通路显著激活。当敲除cGAS或STING时，电转dsDNA的细胞活力显著提高，证明电转长双链DNA诱导原代T细胞死亡主要是由cGAS-STING通路激活导致。

由于cGAS-STING通路具有重要的生物学功能，因此研究者们尝试瞬时抑制cGAS-STING通路，以实现降低电转递送DNA产生的细胞毒性。在试验了小分子抑制剂和siRNA之后，发现STING小分子抑制剂H151无法抑制cGAS-STING激活，而使用siRNA敲低STING需要两次电转递送，对T细胞产生极大的刺激，导致大量细胞死亡。通过高通量筛选电转缓冲液和电转参数后，研究团队发现优化电转缓冲液能显著降低cGAS-STING的激活程度，并且能够有效提高T细胞活力和电转递送效率。

进一步机制研究发现，电转缓冲液的渗透压能够调控细胞内cGAS与DNA的结合亲和力，进而影响第二信使2'3'-cGAMP的产生，最终调节cGAS-STING通路的激活。当电转缓冲液的渗透压为等渗时，cGAS-DNA的结合亲和力降低，仅产生少量2'3'-cGAMP，极大降低了cGAS-STING激活。

最后，研究团队利用等渗电转缓冲液构建CAR-T细胞，该方法产生的CAR-T阳性细胞绝对数比使用商业电转缓冲液多达20倍。与传统的慢病毒递送相比，利用等渗电转缓冲液递送CRISPR构建CAR-T的效率更高，并且具有比慢病毒递送构建的CAR-T细胞更高的抗肿瘤活性。

等渗电转缓冲液通过降低cGAS-STING激活，提高了T细胞的活力和CAR靶向插入效率

综上，该研究发现cGAS-STING通路在电转DNA诱导T细胞死亡中起关键作用，并且揭示了电转缓冲液的渗透压通过调控cGAS-DNA的结合能力，进而影响了该通路的激活。基于该机制的发现，该研究开发了一种准确、高效且安全的递送方法用于构建更有效的CAR-T细胞，为调控cGAS-STING通路的激活打开了新思路，为非病毒递送构建CAR-T的临床转化研究奠定了基础。随着进一步研究和实践，相信非病毒递送方法将在CAR-T细胞治疗领域取得更大的突破，为癌症患者带来更多希望。

武汉大学医学研究院研究生安静、云南大学生命科学学院研究生张川平、武汉大学医学研究院研究生邱厚圆和博士后张红霞为论文共同第一作者。武汉大学医学研究院张楹教授和殷昊教授为论文共同通讯作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01073-7

转自：“生物世界”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！