以下文章来源于植物生物技术Pbj ，作者CGF
番茄是世界上价值最高的水果和蔬菜作物，但它能产生α-番茄碱，这是一种著名的毒性和苦味的甾体类生物碱（SGA），与植物防御有关。番茄果实成熟和成熟过程中的一系列修饰将α-番茄碱转化为无苦味、毒性较小的七叶皂苷A。这种重要的代谢转变防止了成熟番茄果实的苦味和毒性。虽然七叶皂苷A途径中催化糖基化和羟基化反应的酶已经得到解决，但迄今为止，所提出的乙酰化步骤仍然难以捉摸。在这里，研究者们发现了一种BAHD型酰基转移酶---GAME36，在栽培和野生番茄中催化SGA乙酰化。这一发现完成了对成熟番茄中核心七叶 皂苷A生物合成途径的阐明，使得七叶皂苷A在异源微生物和植物宿主中的生产得以重建。GAME36参与苦味SGA解毒途径也表明，它在甜番茄的进化和现代栽培番茄果实的选育中发挥着关键作用。
甾体类生物碱（SGAs）是茄属大多数物种产生的胆固醇衍生的特殊代谢产物，主要用于番茄（茄属番茄）、马铃薯（茄属块茎）等主要主食作物。SGA保护植物免受多种病原体和食草动物的侵害，并在哺乳动物中具有强大的药理活性。
然而，一些SGA被认为可以对人类产生不好的影响，因为它们具有高毒性（例如，土豆中的α-龙葵碱和α-茶锥碱）和苦味，会给人们带来不愉悦的体验。尽管这些臭名昭著的物质对营养质量和销售产生了负面影响，但番茄仍是全球每日消费价值最高的水果和蔬菜作物（数据来自粮农组织《2021年世界粮食及农业统计年鉴》）。
α-番茄碱是一种著名的有毒苦味化合物，是主要的SGA，主要积聚在番茄的叶子和绿色果实中。为了防止自毒作用，α-番茄碱在生物合成后由一种未知的转运蛋白转运并储存在液泡中。在从绿色果实到红色果实的过渡过程中，整个α-番茄碱通过一系列羟基化、乙酰化和糖基化反应，在胞质室中代谢为无苦味和毒性较小的Esculeoside A。
图1 番茄果实发育和成熟过程中Esculeoside A的生物合成途径
研究者们从番茄转录组数据集（NCBI SRA:PRNJNA307656）中选择了16种BAHD类候选蛋白质（不包括先前表征的蛋白质）。该数据集是从番茄五个果实发育阶段的表皮和果肉组织以及各种其他组织（幼叶、花蕾、幼花瓣和根）获得的。为了测试它们在乙酰氧番茄素生物合成中的作用，研究者们从培养的番茄中克隆了每个BAHD候选物，并在大肠杆菌细胞中分别表达。然后用羟基番茄碱作为底物测定纯化的蛋白质的体外酰基转移酶活性。使用短液相色谱-质谱法分析显示，当羟基番茄碱和乙酰辅酶a作为酰基供体孵育时，一种候选物（Solyc08g075210）产生乙酰化化合物，即乙酰氧番茄碱。在这里观察到的乙酰氧番茄碱的峰与在栽培番茄的绿色果实提取物中检测到的峰相同。因此，体外酶分析证实，候选Solyc08g075210，此处命名为GAME36，可以催化乙酰氧番茄碱的生物合成。
图2 GAME36催化栽培和野生番茄中乙酰氧番茄碱的生物合成
而研究者们为了研究SlGAME36酶的动力学性质，测试了它对酰基供体（乙酰基辅酶A、丁酰基辅酶A）和酰基受体的亲和力。体外稳态动力学分析表明，SlGAME36对羟基番茄碱（来自番茄的天然底物）的催化效率高于羟基茄边碱（来自茄子的SGA底物）。总的来说，一系列的结果证明了GAME36酶在体外通过使用各种脂族酰基CoA供体酰化羟基SGAs的混杂性。
图3 重组SlGAME36酶的动力学特性
通过使用CRISPR-Cas9基因组编辑在培养的番茄中产生功能缺失突变体来检测GAME36的体内功能。与野生型相比，研究者们观察到乙酰氧基SGAs前体（即羟基番茄碱和羟基脱氢番茄碱）和额外的上游SGAs（即α-番茄碱和脱氢番茄素）在花和叶组织中的显著积累。此外，GAME36突变系的叶片和花朵都显示出羟基番茄碱异构体的显著增加，这些异构体通常在这些组织中少量存在。
图4 CRISPR-cas9介导的GAME36敲除导致番茄叶片和花朵中乙酰氧番茄碱的减少
研究者们为了研究GAME36活性对成熟相关SGA代谢的影响，比较了野生型和GAME36番茄果实的SGA图谱。对来自GAME36突变体系的绿色果实的分析显示，与野生型绿色果实相比，羟基番茄碱和羟基脱氢番茄碱的积累显著。此外，在GAME36突变系的绿色果实中，没有观察到α番茄碱和脱氢番茄碱水平的重大变化。相反，没有在GAME36绿色水果中检测到乙酰氧基脱氢番茄碱、乙酰氧基番茄碱和乙酰氧基羟基番茄碱。因此，绿色果实中GAME36活性的降低导致乙酰氧基SGAs的完全损失，同时会导致其前体SGAs的积累。
在GAME36突变体系的红色成熟果实中，与同一阶段的野生型果实相比,研究者们检测到羟基番茄碱、羟基番茄碱异构体和羟基脱氢番茄碱SGAs的大量积累。事实上，这些前体SGA是GAME36突变番茄植株果实中的主要SGA。除此之外，研究者们发现，与野生型成熟水果相比，二羟基番茄碱SGA（可能是羟基番茄碱的衍生物）显著降低。总而言之，体内和体外的结果证实，番茄GAME36在Esculeoside A的生物合成途径中催化羟基番茄碱乙酰化为乙酰氧番茄碱。
图5 GAME36突变番茄系的果实表现出SGA代谢的显著改变
总而言之，在这项研究中，研究者们发现了番茄果实中苦味α-番茄碱分解代谢步骤中缺失的酶。并鉴定了一种BAHD型酰基转移酶---GAME36，其在栽培和野生番茄物种中催化各种羟基化的SGA（例如，羟基番茄碱）的酰化。GAME36酰基转移酶的发现不仅完成了番茄果实中无苦味和毒性较小的SGAs的生物合成途径，而且允许在体内和体外重建从α-番茄碱到Esculeosid A的整个代谢途径。该研究结果不仅加深了人们对SGA成分中与成熟相关的代谢变化的理解，更是确保了目前食用的成熟番茄果实的非苦味形式。
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https://www.nature.com/articles/s41467-023-40092-5
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