文献分享 | 通过RNA置换组装控制的CRISPR/Cas9功能的人工基因连接

论文题目：

Establishing artificial gene connections through RNA displacement–assembly-controlled CRISPR/Cas9 function（DOI：10.1093/nar/gkad558）

构建能够重新编程基因网络和信号通路的合成回路是操纵生物系统的长期目标。调控RNA的表达是实现不同细胞功能的重要途径之一,RNA分子的调控通过可预测的碱基互补配对方式实现，因此，利用RNA分子构建细胞工程的合成回路具有可编程性。基于CRISPR的合成回路目前已被广泛应用于RNA编辑来控制特定蛋白质的表达，该回路可以招募不同的效应物从而具有较高的通用性。然而，内源性RNA具有结构多样性和序列独立性，构建内源性RNA之间的人工遗传通信仍面临许多困难。因此，迫切需要开发一种构建内源性RNA连接的方法。

基于此，作者开发了一种新的基于RNA的合成回路。该回路利用工程化的gRNA提出了一种置换组装反应来控制CRISPR/Cas9的功能，实现了在两个原本独立的基因表达之间调控连接。与传统方法不同的是，该回路使用了一种3’-延伸的受抑制RNA（icrRNA），该icrRNA能形成一个发夹结构，其与tracrRNA碱基配对的区域被自身碱基互补掩盖导致无法与tracrRNA组装形成有活性的gRNA。在工程细胞中，icrRNA和tracrRNA通过质粒表达，触发链RNAX通过粘性末端介导的链置换反应与icrRNA结合形成有活性的crRNA，随后与tracrRNA配对组装形成活化的gRNA激活CRISPR/Cas9功能，从而建立RNAX和RNAY之间的人工连接。RNA合成回路的构建情况通过qPCR检测RNA的表达水平判断。此外，作者通过该设计还成功建立了哺乳动物细胞内的人工信号通路来控制细胞凋亡，使用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行分析。对设计的icrRNA进行了优化，最终确定12nt茎结构域和12nt的黏性末端结构域能够高效实现RNA合成回路的构建。

作者设计的RNA回路成功构建了两个原本不相关基因之间的人工连接，将人工基因连接引入哺乳动物细胞中，能够改变细胞表型，具有可编程性、广泛适应性、高度敏感性。另外，将该系统引入哺乳动物细胞在对细胞凋亡的控制方面表现出显著有效性，通过引入miR17和BCL2之间的人工连接使HeLa细胞凋亡率增加15%。

综上所述，作者提出了一种新的基于RNA的合成回路，实现了人体细胞中天然存在的miRNA和mRNA对无关内源基因的调控，解决了内源性RNA之间建立人工连接困难的问题，并进一步证明了可以通过人工基因连接改变细胞的表型。本研究为内源性RNA的人工连接提供了一种简便有效的方法，也为在特定情况下产生新的细胞反应提供了广泛的机会，具有良好的研究前景。

来源：GeneDiscover Hub

转自：“MDL科研助手”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！