导读
蟾酥（VBF）（一种从中华蟾蜍干分泌物中提取的中药）可能对于结直肠癌（CRC）具有一定的疗效。很少有研究者通过系统生物学和代谢组学方法研究VBF在CRC中的综合作用。本研究旨在通过研究VBF对细胞代谢平衡的影响，揭示VBF抗癌作用的潜在机制。我们采用生物网络分析、分子对接和多剂量代谢组学相结合的综合方法来预测VBF在CRC治疗中的作用和机制；通过细胞活力测定、5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（EdU）测定和流式细胞术验证了该预测。研究结果表明，VBF具有抗CRC作用，并通过影响细胞周期调节蛋白，如MTOR、CDK1和TOP2A，影响细胞代谢平衡。多剂量代谢组学分析的结果表明，VBF处理后与DNA合成相关的代谢产物呈剂量依赖性减少，而EdU和流式细胞术结果表明VBF抑制细胞增殖并将细胞周期阻滞在S期和G2/M期。这些发现表明VBF破坏了CRC癌症细胞中的嘌呤和嘧啶通路，导致细胞周期停滞。本研究集分子对接、多剂量代谢组学和生物验证（包含EdU分析和细胞周期分析）于一体，为未来的类似研究提供了基础。
研究亮点：
1. 网络药理学和多剂量代谢组学用于预测VBF治疗CRC的机制；
2. 通过细胞周期阻滞验证了VBF对CRC细胞增殖的抑制作用；
3. VBF破坏CRC细胞中嘌呤和嘧啶的代谢；
4. 网络药理学、分子对接和代谢组学的结果一致。
论文ID
原名：Network pharmacology and metabolomics elucidate the underlying mechanisms of Venenum Bufonis in the treatment of colorectal cancer
译名：网络药理学和代谢组学阐明了蟾酥治疗结直肠癌的潜在机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.06
通讯作者：徐腾飞
通讯作者单位：浙江大学药学院
实验设计
实验结果
1. VBF的化学特性分析
为了阐明VBF的成分和含量，我们对VBF提取物进行了高效液相色谱质谱（HPLC-MS）分析。VBF的总离子色谱（TIC）如图1所示。VBF提取物的化合物定性鉴定揭示了49种化学成分，包括一些蟾毒配基和一些生物碱，详细数据记录在表S2中。图1显示了VBF提取物中蟾毒配基的主要成分（沙地蟾蜍素、gamebufogenin、蟾蜍他灵、蟾蜍灵、华蟾素、脂蟾毒配基和华蟾蜍精）。为了改进对VBF靶点的预测，我们从HERB数据库中收集了39个额外的成分，总共收集了80种VBF化合物，并将其列表于表S3中，以便在化合物-靶点构建中更清晰地可视化。
示意图1 网络药理学与代谢组学联合研究蟾毒治疗结直肠癌的工作流程
图1 VBF提取物中七种主要蟾毒配基（沙地蟾蜍素、gamebufogenin、蟾蜍他灵、蟾蜍灵、华蟾素、脂蟾毒配基和华蟾蜍精）的化学结构。
2. 网络药理学分析
2.1 化合物-靶点和蛋白-蛋白相互作用网络的构建
为了获得全面的靶点预测结果，我们将收集到的80种化合物的典型Smiles输入到SwissTargetPrediction、Similarity Ensemble Approach和SuperPred数据库中，根据与已知活性分子的结构相似性预测潜在靶点。3D结构也被输入到PharmMapper数据库中，以基于药效团图谱预测潜在靶点，结果总共产生895个潜在靶点。通过在DisGeNET数据库中使用“colorectal cancer”作为关键词，我们获得了5472个与CRC相关的靶点。潜在靶点和CRC靶点之间的重叠在维恩图中可视化，获得437个重叠靶点（图2A）。
我们通过组合437个潜在靶点和80个VBF化合物构建化合物-靶点网络，得到524个节点和4694个边（图2B）。为了进一步识别关键靶点，我们使用疾病化合物重叠靶点构建PPI网络，并使用MCODE（Cytoscape中的插件）进行模块分类和聚类分析，结果显示有三个核心簇的得分高于5。第一个簇主要涉及碳代谢和细胞周期通路（图2C），第二个簇主要涉及癌症中的PI3K-Akt信号通路、脂质和动脉粥样硬化、PD-L1表达和PD-1检查点通路（图2D），第三个簇主要涉及PI3K-Ekt信号途径和HIF-1信号途径（图2E）。这些簇包含与癌症密切相关的靶点，如HIF1A、MTOR、MMP9、STAT3和ESR1，表明VBF具有潜在的抗癌作用。然而，需要注意的是，网络药理学分析只提供了一种可能的解释，需要进一步的实验验证。
图2 蟾酥（VBF）在结直肠癌（CRC）治疗中的化合物-靶点网络和蛋白质相互作用（PPI）网络分析
（A）VBF和CRC交叉靶点的维恩图。（B）VBF和CRC相关靶点的化合物-靶点网络。（C–E）从PPI网络中提取的三个主要簇显示了潜在靶点的主要功能基因簇。紫色和红色的节点分别代表VBF中的化合物和潜在靶点。循环节点的颜色越深表示程度越高，靶点大小按度值排列，度值越高表示在治疗过程中发挥更重要的作用。
2.2 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析VBF治疗效果
我们通过对VBF和CRC重叠靶点的KEGG富集分析，揭示了VBF治疗CRC的潜在机制。前10个途径如图3A所示，结果显示细胞增殖和生长相关途径如“PI3K-Akt信号通路”和“HIF-1信号通路”参与其中。PI3K-Akt信号通路在癌症中异常激活，与肿瘤细胞的存活、转移和代谢高度相关。HIF-1途径在缺氧和厌氧条件下促进癌症细胞生长和侵袭，并激活ATP-结合盒转运蛋白，导致细胞内药物浓度降低和耐药性降低。这些发现表明，抑制增殖和生长可能是VBF治疗CRC的主要作用。我们还进行GO分析以收集在VBF抗CRC治疗过程中的有关分子功能（图3B）、生物过程（图3C）和细胞成分信息（图3D）。结果表明，其主要生物学过程包括核苷酸代谢过程、磷酸核苷代谢过程和MAPK级联的正调控。这些靶点通过DNA转录因子结合、DNA结合转录激活子活性和DNA结合转录激活子活性RNA聚合酶II特异性，在成员筏、囊泡腔和转录调节复合体中发挥作用。GO分析表明，VBF可能干扰核苷酸代谢和DNA转录，影响肿瘤细胞的增殖和生长。然而，KEGG和GO分析还包含其他潜在途径，对富集分析结果的解释需要通过实验进一步验证。
图3 （A）京都基因和基因组百科全书（KEGG）VBF和CRC重叠靶基因的通路分析，列出了前10个通路。（B–D）VBF重叠靶基因的基因本体论（GO）分析。BP：生物过程；CC：细胞成分；MF：分子功能。
3. 分子对接
为了确定VBF的潜在靶点，我们从图2C–E中的每个子网络中选择前20个靶点作为候选。在重对接分析中，我们选择特异性结合位点和均方根偏差（RMSD）小于1.5Å的靶蛋白作为对接模型，这保证了对接模型的准确性。随后，我们选择了具有精确3D结构的VBF的16种蛋白和25种化合物进行进一步的分子对接。热图（图4）显示了16种靶蛋白和25种VBF化合物的最小对接能量。较低的对接能表示更强的结合能力，小于−5.0 kcal/mol的值表示可能结合，而小于−7.0 kcal/mol则表示较强的结合活性。在这些靶点中，MMP9（PDB:6ZR5）、MTOR（PDB:5GPG）和TOP2A（PDB:5GWK）与其他靶点蛋白相比，表现出更高的VBF化合物结合活性。MMP9、MTOR和CDK1（PDB:4Y72）与至少一种主要的VBF化合物具有强的结合活性（对接能＜−10.0 kcal/mol）。在VBF的化合物中，gamabufogenin与MMP9、MTOR、CDK1和TOP2A具有较强的结合活性。VBF中的活性成分，蟾蜍灵、脂蟾毒配基和华蟾蜍精，对MTOR和MMP9表现出较强的结合活性。因此，TOP2A、MMP9、MTOR和CDK1被认为是VBF抗CRC作用的关键靶点。
图4 VBF的化合物和靶蛋白之间的分子对接结果
（A）热图表示16种靶蛋白和25种VBF化合物的最小对接能量，更深的颜色表示更强的结合活性。靶蛋白呈现在X轴上，化合物呈现在Y轴上。VBF的7个主要化合物和4个细胞周期相关蛋白用红色标记。（B–E）显示了关键靶点MMP9、MTOR、TOP2A和CDK1的最佳配体的分子对接模式，绿色线表示氢键相互作用，红色弧表示疏水相互作用。
图4B–E显示了关键靶点与其最佳配体的特异性结合模式。华蟾蜍精进入TOP2A活性中心，主要通过疏水相互作用和与Ser802的氢键，其活性中心包括dC14、dC8、dG13、Met766、Pro803和Met762。TOP2A调节DNA拓扑结构的改变，这是DNA转录和复制所必需的（“TOP2A-DNA拓扑异构酶2-α-智人（人类）|UniProtKB|UniProt，”n.d.）。Argentinogenin主要通过与Leu188、Val233、Tyr248、Leu187和His190的疏水相互作用进入MMP9的活性中心（图4C）。MMP9在细胞外基质的局部蛋白水解、白细胞迁移和癌症转移中至关重要。华蟾素通过疏水相互作用和与Ser2035和Tyr198结合的氢进入MTOR（由Val171、Leu162、Tyr2105、Phe2039和Tyr2104构建）的活性中心（图4D）。MTOR调节细胞对DNA损伤等应激反应，并控制蛋白质合成、细胞生长、增殖和细胞周期进展。CDK1的活性中心主要由Leu55、Asp146、Val145、Asp86、Ser84、Met85、Phe80和Val64等组成。Gamabufogenin与CDK1的Phe147、Ile10和Leu83残基相互作用（图4E）。CDK1通过促进G2-M过渡和DNA同源重组修复，在调控真核细胞周期中发挥关键作用。根据分子对接的结果，四个关键靶点中的三个（CDK1、TOP2A和MTOR）参与了DNA的修复、合成、复制和转录，其中CDK1和TOP2A与细胞周期有直接关系。因此，我们推测VBF的抗CRC作用主要是由于细胞周期的停滞。
图5 VBF对SW620细胞株的抗增殖作用
（A）显示了VBF的抗CRC作用的结果，并且（B）显示了EdU测定的结果。（C）中的图像代表了三个独立的实验，并且说明了由于VBF以剂量依赖的方式处理而导致增殖细胞的减少。星号表示统计显著性（与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****<0.0001）。
4. VBF通过细胞周期阻滞抑制细胞增殖
为了验证VBF对结直肠癌（CRC）的抗癌作用，我们使用0.32至25000 ng/mL的不同浓度VBF对SW620细胞进行了细胞活性测定。VBF显示出强大的抗CRC作用，计算的IC50为96.6 ng/mL（图5A）。为了进一步研究抗CRC作用的机制，我们用VBF处理SW620细胞24小时用于EdU测定（图5B–C）。结果显示增殖细胞以剂量依赖的方式减少（图5B），表明VBF的抗CRC作用主要是由于抑制细胞增殖。
图6 进行非靶向代谢组学分析以确定用VBF处理的SW620细胞中的潜在代谢变化
（A–B）在不同VBF剂量下，对照组和处理组的离子比较存在显著差异。（C）正离子和（D）负离子模式下处理组（VBF为12.5、25、50和100 ng/mL）的PCA评分图。
5. 代谢组学分析
为了进一步了解VBF如何影响CRC，我们在低于IC50的浓度（IC50的两倍稀释，即12.5、25、50和100 ng/mL的浓度）下进行了代谢组学研究。VBF处理后，显著上调和下调的离子数量以剂量依赖的方式增加（图6A–B）。主成分分析显示，与对照组相比，处理细胞的代谢谱发生了显著变化（图6C-D）。
图7 VBF处理SW620细胞后的代谢组学分析结果
（A）处理组中显著变化的代谢产物的热图。（B–F）图表描绘了VBF对特定代谢物的剂量依赖性调节，每个红点代表一个单独的实验。
VBF处理后，我们在SW620细胞中共鉴定出127种不同的代谢产物（图7A）。一些关键代谢产物，如UTP、ATP、GTP、CTP和UDP，在对VBF的反应中以剂量依赖的方式下调，同时上调腺嘌呤（图7B–E）。多剂量代谢组学是提高药物发现和开发效率和准确性的宝贵工具。在多剂量代谢组学中，ED50值是通过向样本群体施用不同剂量的药物并测量个体代谢谱的相应变化来计算的。我们发现VBF对ATP、CTP、UDP、肌酸和腺嘌呤的ED50值分别为6.62、7.62、7.15、21.72和13.54 ng/mL。此外，腺嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷的水平上调，表明核苷利用受到影响。核苷酸代谢的变化被认为有助于抑制癌症细胞的增殖，从而提高癌症治疗的疗效。
降低癌症细胞中的ATP水平被认为是癌症治疗的一种潜在策略，因为癌症细胞依赖糖酵解产生的ATP来支持其生长。CTP在DNA和RNA合成以及磷脂生物合成中发挥作用，对细胞增殖至关重要。肌酸水平的降低可能阻碍高能磷酸盐的递送，导致细胞增殖的抑制。嘌呤和嘧啶补救物质的上调表明，这些途径被VBF抑制，从而阻断DNA合成并阻碍癌症细胞增殖。分子对接结果表明，VBF的主要靶点是MTOR，它驱动癌症细胞中嘧啶和嘌呤的从头合成。因此，VBF可以抑制挽救和从头合成途径以阻断DNA合成。根据代谢组学分析，嘌呤和嘧啶代谢紊乱导致的DNA合成抑制可能最终导致细胞周期停滞。
图8 （A）ChemRICH对处理组的弦图分析。条带将各组与其分析结果联系起来，表明核苷的代谢受到VBF的显著影响。（B）KEGG分析结果的弦图显示，三个VBF处理组的嘌呤和嘧啶代谢途径被破坏。
5.1 KEGG和ChemRICH分析了显著变化的代谢物
ChemRICH是一种基于化学相似性的统计富集方法，可以对具有相似结构的代谢物进行聚类。ChemRICH分析证明了VBF对核苷酸代谢的显著影响，显示在所有处理组中都涉及鸟嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、嘌呤核苷和嘧啶核苷酸簇（图8A）。此外，KEGG富集分析（图8B）证实了VBF对所有处理组的嘌呤和嘧啶代谢途径的显著破坏。这些结果突出了VBF对核苷酸代谢的显著影响。
为了证明VBF抗CRC作用背后的机制，我们对暴露于浓度为50和100 ng/mL VBF的SW620细胞进行细胞周期阻滞分析。VBF以剂量依赖的方式降低了G0/G1期细胞的比例，并增加了S期和G2/M期细胞的比率（图9A-B）。根据分子对接的结果，TOP2A和CDK1可能是VBF的主要靶点。TOP2A参与去连接检查点的调控，该检查点在G2期阻滞细胞并延迟有丝分裂，直到姐妹染色单体完全分离。TOP2A的抑制导致DNA再连接和缠绕缺陷，导致DNA损伤，诱导DNA损伤反应和细胞凋亡。CDK1与细胞周期蛋白B联合调节G2/M检查点，控制有丝分裂的进入。CDK1或DNA损伤的抑制可导致G2/M停滞，可能诱导细胞凋亡。可以推断，VBF引起的细胞周期阻滞主要是通过抑制TOP2A和CDK1引起的（图9F）。
图9 VBF对细胞周期进程的影响
（A）VBF影响细胞周期进展（平均值±标准差，n=3），与对照组相比，*P<0.05，***P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。（B）通过流式细胞术测定细胞在不同阶段的分布。将各组的计数标准化为G1进行比较。用不同浓度的VBF处理细胞的荧光脉冲分析（C）对照组，（D）50 ng/mL的VBF，（E）100 ng/mL的VBF的图像。X轴和Y轴表示碘化丙啶-W的荧光脉冲宽度和碘化丙啶-A的荧光脉冲面积。蓝色、红色和绿色点分别表示G1、S和G2/M期的细胞。（F）根据分子对接结果推断出的细胞周期阻滞图，表明TOP2A和CDK1在调节细胞周期进展中的作用。
结论
本研究结果表明，VBF可能通过抑制CDK1和TOP2A以及破坏DNA合成的核苷酸代谢，通过细胞周期阻滞机制发挥其抗CRC作用。此外，本研究提供了令人信服的证据，支持VBF在CRC治疗中的潜在治疗应用，值得在临床环境中进行进一步研究。该研究结合了网络药理学、分子对接和多剂量代谢组学来阐明VBF对抗CRC的作用模式。这些方法的整合使我们能够全面了解VBF与其靶点之间的相互作用，以及其作用所涉及的代谢途径。分子对接预测药物靶点亲和力，而网络药理学评估疗效和毒性，多剂量代谢组学揭示了重复给药引起的代谢变化。通过合并这些方法，药物预测得到了生物学数据的证实，从而提高了准确性，降低了假阳性的风险。总之，网络药理学、分子对接、多剂量代谢组学和生物验证的结合提供了一种强有力的策略，可以加深我们对药物作用的了解，提高药物发现和开发的效率以及准确性。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37315651/
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