ACS Cent. Sci. | 小分子化合物诱导蛋白质相分离的新化学基因工具

英文原题：Chemogenetic Minitool for Dissecting the Roles of Protein Phase Separation

通讯作者：Xiaokun Shu, University of California ─ San Francisco

作者：Chan-I Chung, Junjiao Yang, and Xiaokun Shu*

背景介绍

生物分子凝聚体是在多个细胞过程中发挥关键作用的生物结构，其中许多是无膜细胞器。对这些结构的基本理解有两个重要突破，(1) 揭示了生物凝聚体是通过相分离形成的。(2) 相分离通常由多价相互作用驱动。多价性可由蛋白质中多个结构域或形成寡聚物的单一结构域引入，以及包含多个带电或芳香残基的无序区域（intrinsically disordered regions）提供弱多价相互作用，或通过"stickers-and-spacers"模型实现。

最近对几种转录因子的研究表明，它们经历相分离并形成凝聚体。尽管许多转录因子凝聚体含有转录机器，相分离是否真正改变转录活性仍然存在争议。这个关键问题的答案受到概念和技术挑战的阻碍。一些研究通过引入突变研究相分离与转录活性的关联，这些突变通常被引入到具有促进相分离的IDR的转录因子的活化结构域中，但活化结构域通常与RNA聚合酶II的相互作用有关。因此，转录因子凝聚体是否影响其转录活性仍存在争议。要研究相分离在转录中的作用，迫切需要新的工具使我们能够在不引入突变或改变表达水平的情况下评估凝聚物的转录活性。

文章亮点

开发出能够操纵相分离的新型化学遗传学工具，并具有几个特点：

(1)使用经FDA批准的药物分子；(2)蛋白质相互作用对的大小比FKBP-Frb小，其中一个标签仅为约30个氨基酸；(3) 相互作用较弱，更好地模拟了大多数生物凝聚体中的弱相互作用；(4) 药物诱导可实现对相分离的定量操控。

这种强大的新型工具使研究者能够将相分离的作用与蛋白表达水平或突变引起的变化解耦。此外，与基因组分析方法兼容的工具有助于转录谱分析以及研究相分离在基因调控中的作用。

图文解读

作者先前的研究表明，当Cereblon (CRBN) 和 Ikaros (IKZF1)蛋白质与多价标签结合时， lenalidomide能够诱导凝聚体形成。為避免目的蛋白泛素化和降解，作者撷取透过lenalidomide与IKZF1相互作用，但不直接结合DDB1的CRBN C-末端结构域(CEL)。接着只保留IKZF1中与CEL相互作用的锌指结构域，称为ZIF。作者通过免疫共沉淀验证了CEL与内源或外源DDB1没有相互作用。为了证明CEL和ZIF能够通过lenalidomide控制蛋白质相互作用，作者将CEL与GTP交换因子SOS的催化结构域融合(SOScat)，将ZIF与带有红色荧光蛋白标记的膜定位序列融合。添加lenalidomide后，SOScat从细胞质转位到细胞膜，SOScat的总蛋白水平没有变化且造成ERK 被激活。证明了由lenalidomide诱导的CEL和ZIF二聚体可以用于控制蛋白质相互作用和细胞信号传递。

作者将CEL融合到HOTag3 (30个氨基酸的六聚体)，ZIF融合到HOTag6 (33个氨基酸的四聚体)，藉由于lenalidomide诱导的蛋白质相互作用系统中引入多价性，以达到操控蛋白质相分离的目的。通过实时观察绿色荧光可以看到添加lenalidomide所诱导的EGFP相分离。初始阶段形成了小的蛋白质液滴（200-400 nm），迅速成长为相对较大的液滴（1.5 μm）。形成凝聚体的多寡和lenalidomide浓度呈正相关。此一过程是可逆的，移除lenalidomide后凝聚体会迅速消失。我们将这项技术命名为SPARK-ON (Separation of Protein phases Activatable and Reversible by small molecule-based Kinetic control)。

作者将SPARK-ON系统进一步应用到研究相分离是否真正改变转录活性。已知山梨醇能诱导渗透压应激，促进YAP运输到细胞核内并形成凝聚体，下游基因CTGF的mRNA水平上升。为了去除激活时会YAP被运输到细胞核内的蛋白浓度变化，作者在YAP上融合了核定位序列，通过添加lenalidomide可以使核内YAP形成凝聚体。此凝聚体能够招募转录机器且含有新生RNA，通过比较有无添加lenalidomide时YAP下游基因CTGF的mRNA水平可以验证转录因子凝聚体是否具有更高的转录活性。最后作者通过RT-qPCR 确定SPARK-ON诱导的核内YAP凝聚体相对于扩散状态，下游基因CTGF的mRNA水平上升了近一倍。

总结与展望

过去十年来，凝聚体生物学是细胞和分子生物学中一个令人兴奋的领域，因为它揭示了一种可能在多种细胞过程中发挥重要作用的新的结构实体。目前，关于生物分子凝聚物存在两个基本的生物学问题。首先，它们是否具有生物活性？越来越多的证据表明，许多生物凝聚物在细胞信号传导中具有生物活性。第二个关键问题是，相分离是否赋予新的或附加的活性，或者仅仅是蛋白质水平的增加或分子变化（如翻译后修饰）的结果？由于概念和技术上的挑战，这个问题大部分仍然没有答案。通过化学遗传学工具SPARK-ON将相分离与蛋白质丰度水平解耦，在理解许多转录因子和其他生物分子凝聚物的生物作用方面具有重要应用价值。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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