导读
砜吡草唑(PYR)是一种广泛使用的除草剂，但其对非目标生物，特别是微生物的影响在很大程度上是未知的。本研究采用rRNA基因扩增子测序和定量PCR技术研究了不同剂量PYR对甘蔗根际微生物组的影响。相关分析表明，一些细菌门(Verrucommicrobia和Rhodothermaeota)和细菌属(Streptomyces和Ignavibacteria)对PYR有强烈的响应。此外，本研究发现30天后细菌多样性和组成都发生了显著变化，表明除草剂的作用延长。此外，细菌群落的共现分析表明，PYR在第45天显著降低了网络复杂性。FAPROTAX分析表明，一些与碳循环有关的功能在30天后发生了显著变化。总体而言，本研究表明PYR在短期内(不到30天)可能不会对改变微生物群落构成重大风险。然而，其对降解中后期细菌群落的潜在负面影响值得进一步关注。本研究是第一项深入了解PYR对根际微生物群影响的研究，为未来的风险评估提供了扩展的基础。
图文摘要
论文ID
原名：Impact of pyroxasulfone on sugarcane rhizosphere microbiome and functioning during field degradation
译名：砜吡草唑在田间降解过程中对甘蔗根际微生物组及其功能的影响
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：13.6
发表时间：2023.5
通讯作者：柏连阳，金德才
通讯作者单位：湖南省农业科学院；中国科学院生态环境研究中心
DOI号：10.1016/j.jhazmat.2023.131608
实验设计
结果
1 施用PYR对土壤性质的影响
本试验为期60天，分别在喷施PYR后的5个时间点(1、15、30、45和60天)采集土壤样品。大部分PYR降解发生在前30天(图1)。然而，即使在60天后，仍可检测到低浓度的PYR。试验结束时，与喷药后第1天相比，低剂量和高剂量处理的PYR降解率分别为95.23%和93.50%。分析了低、高浓度处理下甘蔗田PYR的降解动态。结果表明，两种PYR浓度的耗散动力学符合指数方程，R2>0.92。PYR在低浓度和高浓度处理组中的半衰期分别为14.44天和14.74天。
此外，还对土壤的物理和化学性质进行了评估(表S1)。在评估的一些土壤性质上观察到了显著差异。例如，对照和处理间土壤有机质(SOM)差异显著(CK vs. H，P<0.05；CK vs. L，P<0.01)，TN和TP也表现出相同的趋势。但不同处理间的pH、MC和An均无显著差异。Pearson分析表明，只有土壤有机质与PYR浓度显著相关(P<0.01)，施用PYR使土壤有机质浓度增加，但对其它土壤性质无显著影响。
图1. 监测60天期间土壤中PYR的耗散动力学。值代表平均值(n=3)，误差条代表标准差(SD)。
2 PYR对细菌丰度和多样性的影响
总共从90个样本中获得了7223,306个高质量过滤reads，平均每个样本80,258个reads。它们被聚类为44,203个细菌OTU，序列同源性为97%。分别用Shannon指数和Chao1指数计算细菌群落的α多样性和丰富度。α多样性的主要变化发生在第30天、第45天和第60天，而Chao1指数在第1天、第30天和第45天显示出显著变化(图3A&B)。为了了解这种差异是否是由PYR施用引起，基于Pearson相关系数进行了相关性分析。结果表明，在整个处理期(60 d)内，PYR的使用对微生物多样性没有影响。然而，pH、MC、SOM、AN、TP和时间点与细菌多样性相关。当单独分析时间点时，在第30天和第60天，PYR是唯一影响细菌多样性(Shannon和Chao1指数)的因素。同时，以每克土壤16S rRNA基因拷贝数为分子指标，测定了根际细菌的丰度。在第15天，PYR处理的细菌总数显著高于CK(P<0.05)，在第45天也有类似的趋势(P<0.05)，图2C)。之后，直到第60天，没有发现任何差异。相关分析表明，在整个评估期间(60 d)，暴露于PYR对总细菌丰度的影响不大，只有SOM与这一因素密切相关(P<0.05)。在每个单独的时间点分别评估了PYR和土壤性质的影响，结果表明，细菌丰度在第30天受到PYR的显著正影响，而pH对第45天的总细菌数量有显著负影响(P<0.05)。总体而言，PYR处理对细菌总数及其多样性的影响可以忽略不计。在整个60天的监测期内，它们更多地受到土壤理化性质的影响。然而，在PYR降解的中后期，PYR表现出显著的负面影响，尤其是在第30天(附表2)。
图2. PYR对Shannon指数、Chao1指数和16S rRNA基因拷贝数丰度的影响。值代表平均值(n=6)，误差条代表标准差(SD)。不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。
3 PYR对微生物群落组成的影响
β多样性分析表明，整个周期内细菌群落结构的差异主要是由时间驱动的，而不是由PYR处理驱动的(图3)。细菌群落是根据五个采样时间点(而非PYR处理)明确分开的(图3)。基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA进一步证实了5个时间点之间的显著差异(均P<0.01)。相似性分析(ANOSIM)和和多响应置换分析(MRPP)表明，H/L处理在第15、30、45、60天与CK处理之间差异显著(P<0.05)，而在第1天则没有影响。为了了解这些差异的潜在原因，采用了partial Mantel检验来评估微生物群落组成与特定变量之间的相关性。在施用PYR后第1天没有观察到土壤理化因素对细菌群落结构的影响；同时，在第15天，pH、MC和SOM对微生物群落结构有显著影响，而在PYR处理的第30、45和60天，只有PYR处理对细菌群落结构有显著影响(表S3)。
在门、属水平上对细菌群落组成进行了分析。最主要的三个门是变形菌门、绿弯菌门和放线菌门，它们共占所有样本中鉴定的reads的49%以上(图4)。Pearson相关分析表明，有几个因素与细菌门显著相关(表S4)。例如，pH与绿弯菌门(P<0.01)、芽单胞菌门(P<0.05)、Ignavibacteriae (P<0.05)丰度呈负相关，与疣微菌门丰度(P<0.01)呈正相关。SOM与绿弯菌门(P<0.01)、Rhodothermaeota (P < 0.01)、Ignavibacteriae (P < 0.01)呈正相关，与厚壁菌门(P < 0.05)、酸杆菌门(P < 0.05)、芽单胞菌门(P < 0.05)和疣微菌门(P < 0.01)呈负相关。PYR也被发现与Rhodothermaeota(P<0.05)和Ignavibacteriae (P < 0.01)的丰度呈正相关，与疣微菌门丰度呈负相关。同时，尽管PYR在不同时间与不同菌群显著相关，但三个最具优势的菌门不受PYR处理的影响。在属水平上，计算了每个土壤样品中前25个属的相对丰度(附图S1)。优势属为unclassified Anaerolineae的一部分，平均丰度为6.29%，其次为未分类的Chloroflexi和Aggregatilinea，其在所有土壤样品中的平均比例分别为5.77%和5.40%。Pearson相关分析表明，前25个属的相对丰度与PYR处理之间没有显著相关性(表S5)。然而，一些优势属受到土壤理化性质的影响。例如，SOM(P<0.01)和TP(P<0.05)显著影响unclassified Anaerolineae的丰度，pH(P<0.01)和TN(P<0.05)显著影响unclassified Chloroflexi。在这些因子中，SOM是影响优势属的主要因子，在25个丰度最高的属中有14个受其显著影响。进一步分析表明，SOM受到许多因素(包括TN、TP、PYR和时间)的显著共同影响。有趣的是，Streptomyces和Ignavibacterium的平均丰度分别为0.49%和0.46%，与PYR浓度呈正相关。
图3. NMDS图表示了当暴露于不同PYR剂量60天时细菌群落的β多样性。CK：对照，L：建议喷洒PYR剂量；M：喷洒推荐PYR剂量的5倍。D1、D15、D30、D45和D60分别表示在第1、15、30、45和60天采集的样本。
图4. 不同剂量PYR喷施60天后门水平上的细菌群落结构。仅显示占整个群落至少1.0%的门，其余的被归类在“Others”。所显示的值是六次重复的平均值。
4 PYR对氮循环相关基因的影响
固氮、硝化和反硝化过程是由携带多种编码不同酶的基因的某些微生物介导的。为了确定PYR处理是否影响甘蔗田土壤氮素循环，我们量化了与固氮(nifH)、硝化(AOB和nxrA)和反硝化(narG、nirS、nirK和nosZ)相关的特定N循环基因的丰度。研究发现，PYR处理对不同基因表现出不同的影响(图5)。在第15、30、45天，PYR处理组的AOB丰度高于CK组，第15天显著增加(P=0.044)，且其丰度随PYR浓度的增加而增加。在亚硝酸盐氧化方面，在第15天，PYR处理的相关基因丰度显著高于CK组，而在其他时间点则没有统计学差异。关于反硝化过程，在第15天和第30天，PYR处理的narG丰度显著高于PYR处理，nirK基因也有类似的趋势。此外，在第15天，PYR处理组的nirS丰度显著较高，而nosZ基因在所包括的任何时间点均未观察到显著差异。表S6显示了基因丰度与不同因素(土壤参数、时间和PYR暴露)的相关分析结果。除narG基因外，SOM与固氮(nifH)、硝化(AOB和nxrA)和反硝化(nirS、nirK和nosZ)相关基因的丰度呈显著正相关(P <0.01)；TP与nirS、nosZ基因丰度呈正相关(P<0.05)；AOB、nxrA和nosZ的丰度与时间呈显著负相关(分别为P<0.01、P<0.01和P<0.05)。除第15天AOB与PYR显著相关(P<0.05)外，在整个处理期间，特别是第1、15、30、45和60天的相关分析中，未发现任何其他氮循环相关基因与PYR处理之间存在显著相关性。
此外，还进行了FAPROTAX分析，以进一步探索不同剂量PYR对细菌群落实现的各种功能的影响(图6)。FAPROTAX鉴定的主要微生物功能是参与C(化能异养、需氧化能异养、光养和光异养等)和N(硝化、好氧氨氧化、硝酸盐还原、硝酸盐呼吸和氮呼吸等)的生物地球化学循环过程。最常见的3个功能团是化能异养、需氧化能异养和硝化，其平均比例分别为26.43%、23.63%和9.11%。研究土壤理化性质与细菌功能的相关性发现，在整个60 d的监测期间，TN是与主要功能相关的最重要因子。然而，没有观察到PYR的影响。当评估特定时间点时，发现光异养和光养在第30天和第45天都受到PYR的显著影响。另一方面，值得一提的是，在任何时间点都没有N相关功能与PYR相关，这表明PYR处理对它们没有影响。这些结果与nifH、nxrA、narG、nirS、nirK和nosZ基因的实时定量PCR结果一致。
图5. 在监测的60天期间，不同PYR剂量下氮循环相关基因丰度的变化。数据为6个生物重复的平均值±SD。上方不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。
图6. FAPROTAX数据库中不同基因相对丰度的热图及其与土壤理化变量的相关性。标签“Over 60 days”表示在本研究框架内监测的整个时期内细菌群落的功能分析；D30和D45分别表示专门在第30天和D45天进行的功能分析。*P<0.05，**P<0.01。
5 PYR对细菌共现网络的影响
共构建了两个时间点(D30和D45)的六个网络，以确定PYR对细菌相互作用的影响。如表S7所示，六个网络的平均聚类系数、模块化等大多数参数均显著高于随机网络，表明这六个网络是基于相互作用的普遍性。PYR处理后总节点数在第30天显著减少，在第45天显著增加。而CK组在第45天的总连接数(3962)、平均度(10.159)和聚类系数(0.513)较高。模块化(0.661)和模块数(101)均低于PYR处理的网络。六个网络中的大多数节点都是外围节点。在30天内，高剂量处理仅检测到1个connector hub和2个模块hubs，低剂量组检测到最多hubs，包括1个connector hub和5个模块hubs。在第45天，低剂量组检测到的hubs数量最少(2个模块hubs)，而高剂量组的hubs数量最多(4个connector hubs和7个模块hubs)。在所有样本的hubs中，变形菌门是最丰富的门。在33个hubs中，13个在属水平上分类，其余的属于未分类的分类群。OTU_297、OTU_9728、OTU_1693、OTU_268和OTU_47分别属于Chryseotalea、Ohtaekwangia、Subdivision3 genera incertae sedis、Pelagibius和Luteolibacter，在高剂量处理45天后检测到。值得注意的是，在6个网络中没有发现网络hubs，六个网络中也没有发现共享的模块hubs或connectors，这表明PYR处理极大地改变了关键微生物种群和网络结构，特别是在第45天。
图7. PYR处理30天和45天根际土壤细菌群落的网络共现分析。八个主要模块以八种不同的颜色显示，而其他模块则以灰色显示。每个节点的大小与连接数(度)成正比。红边表示两个细菌节点之间的正相互作用，而蓝边表示负相互作用。
讨论
杂草对全球植物生产有重大影响，因此与粮食安全有关。它们可以与农作物争夺养分、光、水和空间，导致巨大的农业经济损失。PYR是最近推出的一种除草剂，用于控制许多一年生杂草和阔叶草。评估PYR对非目标土壤生物群的影响对于评估其在农业上应用的可持续性具有重要意义。本研究从分类和功能层面综述了PYR对根际细菌的影响，以及对土壤氮循环的影响。
PYR在施用后的早期阶段对细菌多样性没有影响，但在其降解的后期阶段观察到微生物多样性的减少，特别是在第60天。以往的研究表明，不同的除草剂对土壤微生物多样性有不同的影响。例如，Du等人报道了与本研究类似的结果，他们表明环氧康唑处理在特定时间点降低了粉质壤土和粉质粘土中的细菌多样性。Lupwayi等人报道称，草甘膦对小麦根际原核生物和真菌α多样性指数均无影响。在另一项研究中，暴露于禾草灵10天后，根际微生物组中的细菌丰富度高于相应的对照。在本研究中，对细菌总数的定量分析也显示出类似的趋势。在评估整个监测期时，它们也没有受到PYR的影响，然而，在第15天和第30天，所有PYR处理的细菌总数都增加了。2018年，Mandl等人也表明，除草剂下的细菌总数比机械除草平均高260%。
土壤因子SOM是本研究中影响细菌群落的最重要理化因子，这与Gao等人的研究结果相似。此外，细菌群落也受到时间的显著影响，这与之前的一项研究一致，该研究发现β多样性受时间的影响，而不是农药处理。施药后，整个土壤微生物群落呈现出明显的聚类，且大多呈时间依赖性。在过去的几年里，对土壤微生物只有轻微影响的其他除草剂经常被报道。Kepler等人调查了草甘膦对抗草甘膦作物根系土壤微生物群落的影响，没有发现明显的影响。在另一项研究中，Bottrill等人没有观察到短期施用除草剂对土壤细菌群落结构的影响。同样，Araujo等人也表明除草剂咪草烟和氟草净在短期内不会对植物生长促进细菌群落产生负面影响。此外，Tang等人发现，施用一定剂量的草甘膦对甘蓝型油菜根际细菌群落结构没有不利影响。然而，本研究观察到，在整个监测期间，施用PYR后，一些细菌类群的丰度发生了显著变化，包括Verrucommicrobia、Rhodothermaeota和Ignavibacteriae。这些细菌大多与污染物降解和除草剂胁迫有关。例如，Huang等人报道称，在阿特拉津处理下，疣微菌门的丰度显著下降。此外，先前的研究报道Ignavibacteriae成员能够降解腐植酸和苯环的裂解。在属水平上，丰度最高的前25个属与PYR浓度无显著相关性。然而，在所有样本中发现Streptomyces和Ignavibacteria两个属与PYR显著相关。已知Streptomyces能够在熏蒸剂胁迫和农药胁迫下生存，如除草剂二氯喹啉酸和杀虫剂氟虫腈。据报道，Ignavibacteria能够降解对硝基苯酚和氯化石蜡。因此，本研究的数据结合上述研究表明了这两个属可能参与PYR的降解。
本研究还利用FAPROTAX、qPCR分析和共现网络对甘蔗根际细菌进行了表征。分析表明，在评估整个监测期时，PYR对预测功能没有影响。相比之下，在第30天和45天，PYR处理显著改变了一些预测功能。例如，在第45天，除草剂的施用增加了与需氧化能异养和化能异养相关的微生物群的丰度。这一结果与Pertile等人报道的结果相似，后者表明在应用Flumyzin后，与化能异养相关的微生物群的丰度增加。在另一项研究中，化能异养菌也被除草剂异恶草酮促进。在其他类型污染物的胁迫下，Kong等人发现，当细菌群落按照浓度梯度暴露于邻苯二甲酸二丁酯时，化能异养和需氧化能异养菌的相对丰度显著增加。利用化能异养的微生物通常是分解者，并且经常参与有机污染物的修复和物质循环。它们丰度的增加表明具有降解除草剂能力的群落成员增加。此外，在第30天和45天，PYR处理与光养和光异养的相对丰度均呈负相关。这一结果可能表明，PYR抑制了光养微生物，而光养微生物在自然界中可以利用光能进行各种代谢过程。以前的文献表明，除草剂可以干扰淡水、河口和沿海海洋生态系统中的水生光养生物。由于化能异养、需氧化能异养、光养和光异养为碳循环提供了重要的生态服务，因此可以推断PYR对碳循环有显著的影响。Shi等人也描述了类似的现象，其中3,6-二氯咔唑对土壤碳循环的影响最为显著。有趣的是，PYR不影响与氮循环相关的功能，如固氮、硝酸盐反硝化、硝酸盐还原、硝化和亚硝酸盐反硝化。
本研究通过qPCR靶向功能基因，以明确PYR对土壤氮循环所涉及的生物过程的潜在影响。与功能预测结果一致，与氮循环相关的基因(nifH、AOB、amoA、nxrA、narG、nirK/nirS和nosZ)与PYR无关。此前，农用化学品对氮转化基因的影响已有文献记载。例如，异恶草酮抑制了固氮细菌，而显著促进了AOB。在另一项研究中，Du等人报告称，土壤中固氮细菌在氟环唑处理下也有所增加。两种除草剂氯酯磺草胺和双氯磺草胺对硝化作用有抑制作用，而对反硝化作用有促进作用。本研究还表明，PYR处理在特定时间促进了一些参与氮转化的基因。例如，固氮细菌在第15天显著增加，硝化过程(AOB amoA和nxrA)和反硝化过程(narG和nirS)也呈现相同的趋势。然而，相关分析表明，它们的变化与PYR处理无关，而与特定的土壤理化性质(如pH和SOM)显著相关。
生态网络分析可以增强我们对微生物在农药胁迫下相互作用的理解。Shi等人研究表明，暴露于3,6-DCCZ可以促进微生物间的相互作用，但这种促进作用随着浓度的增加而减弱。另一项研究表明，两种土壤在氟环唑处理下，网络密度和平均度均有所增加。如图7所示，在本研究中，在第45天观察到了网络的显著变化。尽管PYR处理促进了网络模块化、模块数、平均路径距离和总节点数等，但对照组的网络具有较高的总连接数、平均度和平均聚类系数，这表明该时间点PYR处理的群落网络连通性较低且较简单。
总体而言，除草剂会影响土壤微生物群落，这可能会对土壤健康产生不利影响。由于群落水平的观察结果不能反映微生物功能的差异，因此需要使用其他方法(如宏基因组学、宏转录组学和代谢组学)来进一步阐明PYR对农业系统的潜在影响。同时，PYR降解物的相关知识将有助于在不同环境中实施除草剂的生物修复方法。本研究的结果可以在应用浓度、植被类型、土壤性质等方面进一步扩展。此外，未来还需要进行更多的实地试验，以系统地评估PYR的生态影响和降解机制。
结论
本文旨在研究在60天内施用PYR对甘蔗根际微生物组的影响。结果表明，在整个监测期内(60天)，施用PYR对细菌群落、微生物功能和氮转化过程几乎没有影响。然而，在PYR降解的中后期阶段观察到了特定的影响。30 d后，细菌群落的α多样性和β多样性与PYR浓度呈显著正相关。此外，PYR处理后第30天和第45天，碳循环相关官能团发生了显著变化。此外，暴露于PYR降低了细菌网络的复杂性。此外，不同类群(Rhodothermaeota和疣微菌门)的相对丰度与PYR呈正相关或负相关。处理还丰富了Streptomyces和Ignavibacterium，表明它们可能参与PYR的降解。因此，PYR在其降解后期对微生物群落的影响值得进一步关注。还需要更多的研究来验证我们在不同土壤和不同田间条件下的发现。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389423008919
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