Nat Chem Biol | 江南大学刘延峰团队开发了新型的系统，可作为原核细胞持续进化的有力工具

持续的进化可以产生用于合成生物学的生物分子，并使进化研究成为可能。酵母的正交DNA复制系统(OrthoRep)能够以一种易于操作的方式有效地使长DNA片段发生突变。然而，这种系统在细菌中是缺乏的。

2023年7月13日，江南大学刘延峰团队（田荣臻为第一作者）在Nature Chemical Biology 在线发表了题为“Engineered bacterial orthogonal DNA replication system for continuous evolution”的研究论文，该研究开发了一种细菌正交DNA复制系统(BacORep)，用于持续进化。该研究通过利用苏云金芽孢杆菌中温和的噬菌体GIL16 DNA复制机制和一种易出错的正交DNA聚合酶来实现这一目标。

该系统能够以高于基因组突变率6700倍的速度进化正交线性质粒上的目的基因，且突变包括全部12种碱基替换，进化的目的基因或基因簇可长达15 kb。利用该系统，不仅成功进化出了适用于典型模式微生物大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的强启动子，还通过进化甲醇同化基因簇，大大提高了宿主对甲醇的利用效率。总之，研究结果说明BacORep是原核细胞持续进化的有力工具。

定向进化促进了为制药和合成生物学应用量身定制的重要遗传元素和蛋白质的发展。其中，经典的离散定向进化需要在体外产生突变文库，并伴随着多轮DNA转化和选择，这往往是劳动密集型的，并且可能受到进化实验规模的限制。因此，为了克服这些局限性，不断演化的方法得到了发展。持续进化在体内实现了DNA序列的多样化。

根据实现碱基突变的机制不同，可分为三类：(1)基于表观遗传修饰的超突变(利用诱变机制在碱基上引入修饰，在复制过程中实现DNA错配)。例如，CRISPR-Cas9或T7 RNA聚合酶和胞苷脱氨酶的融合可以对特定目标DNA进行随机碱基编辑。(2)重组依赖性超突变(利用错误的单链DNA (ssDNA)作为冈崎片段在DNA复制过程中引入突变)。例如，大肠杆菌和酿酒酵母的基于回溯元素的持续进化工具。(3)基于易出错复制的超突变(在复制过程中直接引入DNA链突变)。例如，正交DNA复制系统(OrthoRep)、噬菌体辅助连续进化(PACE)工具、基于CRISPR引导的易出错DNA聚合酶(DNAP)的连续进化工具和靶向易出错人工DNA复制体(TADR)。

通常，碱基突变类型和可调突变窗口根据上述连续进化工具而变化。例如，与Cas9融合的碱基编辑器胞苷脱氨酶(第一类)被开发用于靶向主要在5个碱基对(bp)内的狭窄突变窗口。基于后向元件的连续进化系统(第二类)与基因组正交，但主要适用于30bp左右的突变窗口。TADR(第三类)已被证明进化出长达1600 bp的突变框架。然而，将基因组突变率提高78倍可能会破坏持续进化的持久性。因此，有必要开发工具，在不影响宿主细胞基因组复制的情况下，实现所有12种长靶基因核苷酸替代类型的长期连续进化。

目前，在酿酒酵母中建立的正交DNA复制系统(OrthoRep)是一种连续进化的最佳方法，可以在不增加基因组突变率的情况下，在正交复制的线性质粒上有效地进化出长靶基因(22,000 bp)。它已经成功地用于揭示合成生物学中遗传回路的进化机制和进化的关键组成部分。然而，在酿酒酵母中，由OrthoRep进化而来的基因表达调控元件或蛋白可能适用于真核生物，但在原核生物中可能不起作用。因此，迫切需要开发一种基于正交易出错DNA复制机制的细菌连续进化系统，特别是以易于操作的方式高效地突变长靶基因。

BacORep工作示意图（图源自Nature Chemical Biology ）

该研究设计并实施了三种平行方法来开发细菌正交DNA复制系统(BacORep)。这包括重新设计和引入枯草芽孢杆菌裂解噬菌体φ29和苏云金芽孢杆菌温带噬菌体GIL01的DNA复制机制，以及重组苏云金芽孢杆菌原噬菌体GIL16。通过劫持在苏云金螺旋藻中正交复制的温带前噬菌体GIL16，该研究在苏云金螺旋藻中获得了一个稳定的、可工程的线性质粒。这使得引入和正交复制感兴趣的基因(GOIs)独立于基因组。接下来，通过alphafol2d辅助结构预测和合理工程，提高BacORep体系的突变率，获得易出错的正交DNA聚合酶。最后，利用BacORep在体内的持续进化，产生了强大的启动子，用于模式细菌枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)，并提高了甲醇同化基因簇的合成效率。该研究结果表明，BacORep能够实现遗传元件和细胞功能的有效进化，为原核细胞的合成生物学和进化研究提供了强有力的工具。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-023-01387-2

转自：“iNature”微信公众号

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