原核
氨苄青霉素Ampicillin、卡那霉素kanamycin、氯霉素chloramphenicol、壮观霉素Spectinomycin、四环素 tetracycline、博来霉素Zeocin/blemycin、链霉素Streptomycin、潮霉素Hygromycin、庆大霉素Gentamicin、硫酸安普霉素Apramycin sulfate、红霉素Erythromycin、诺尔斯菌素Nourseothricin
真核
G418 Neomycin、嘌呤霉素 Puromycin、潮霉素B HygromycinB、博来霉素 Zeocin/bleomycin、诺尔斯菌素Nourseothricin
具体作用机理及其抗性基因序列
G418（Geneticin,遗传霉素）
作用机理：通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成。
耐药机理：当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达。氨基糖苷磷酸转移酶能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化。从而抑制其与核糖体结合失去抗菌活力。
抗性基因序列和kanR的一样，但是表达元件得用真核的
ATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA
酵母：0.25-0.5mg/mL，抗性压力筛选可往上调。不明来源的酵母以此为基础上调摇菌验证。
细胞：200mg/mL
Amp（ampicillin，氨苄青霉素）
抗性基因序列
TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGGCTCCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT
作用机理：青霉素属于β-内酰胺类抗生素，是作用于细菌细胞壁的抗生素。青霉素通过抑制细菌的转肽酶活性，发挥抑制细菌合成细胞壁的作用，从而杀灭细菌。细菌的细胞壁是包裹在细菌最外面的一层刚性结构，它决定着细菌的形状，保护细菌不因内部的高渗透压而破裂。细菌细胞壁的主要成分是黏肽，是具有网状结构的含糖多肽。细菌在合成细胞壁的过程中，需要黏肽转肽酶的催化。青霉素的作用就是抑制黏肽转肽酶，使其不能催化转肽反应，从而阻碍细菌合成细胞壁，进而导致细菌死亡。
耐药机理：β-内酰胺酶（β-lactamase）可以将氨苄结构中的四元内酰胺环β-内酰胺（β-lactam）水解。
携带bla基因的质粒转入大肠后，大肠杆菌表达β-内酰胺酶，在有氨苄西林的环境下生存下来。
β-内酰胺酶分泌到细胞外后随着细菌的生长，培养基中的β-内酰胺酶会不断增加，培养基重的氨苄西林被降解，周围会长出卫星菌落，属于正常现象。
大肠：100mg/mL
Kan（Kanamycin，卡那霉素）
抗性基因序列和G418的一样，但是表达元件得用原核的
ATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA
大肠：100mg/mL
zeocin（博莱霉素）
作用机理：Zeocin 可通过嵌入和裂解 DNA 来导致细胞死亡。
耐药机理：由 Shble基因产物实现对 Zeocin 的耐受性，它可结合抗生素，防止其结合 DNA。
大肠：25-50μg/mL(低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；
酵母：50-300ug/mL
细胞：50-1000ug/mL
Tet（Tetracycline，四环素）
tetR sequence
ttagaaatccctttgagaatgtttatatacattcaaggtaaccagccaactaatgacaatgattcctgaaaaaagtaataacaaattactatacagataagttgactgatcaacttccataggtaacaacctttgatcaagtaagggtatggataataaaccacctacaattgcaatacctgttccctctgataaaaagctggtaaagttaagcaaactcattccagcaccagcttcctgctgtttcaagctacttgaaacaattgttgatataactgttttggtgaacgaaagcccacctaaaacaaatacgattataattgtcatgaaccatgatgttgtttctaaaagaaaggaagcagttaaaaagctaacagaaagaaatgtaactccgatgtttaacacgtataaaggacctcttctatcaacaagtatcccaccaatgtagccgaaaataatgacactcattgttccagggaaaataattacacttccgatttcggcagtacttagctggtgaacatctttcatcatataaggaaccatagagacaaaccctgctactgttccaaatataattcccccacaaagaactccaatcataaaaggtatatttttccctaatccgggatcaacaaaaggatctgttactttcctgatatgttttacaaatatcaggaatgacagcacgctaacgataagaaaagaaatgctatatgatgttgtaaacaacataaaaaatacaatgcctacagacattagtataattcctttgatatcaaaatgaccttttatccttacttctttctttaataatttcataagaaacggaacagtgataattgttatcataggaatgagtagaagataggaccaatgaatataatgggctatcattccaccaatcgctggaccgactccttctcccatggctactatcgatccaataagaccaaatgctttacccctattttcctttggaatatagcgcgcaactacaaccattacgagtgctggaaatgcagctgcaccagccccttgaataaaacgagccataataagtaaggaaaagaaagaatggccaacaaacccaattaccgacccgaaacaatttattataattccaaataggagtaaccttttgatgcctaattgatcagatagctttccatatacagctgttccaatggaaaaggttaacataaaggctgtgttcacccagtttgtactcgcaggtggtttattaaaatcatttgcaatatcaggtaatgagacgttcaaaaccatttcatttaatacgctaaaaaaagataaaatgcaaagccaaattaaaatttggttgtgtcgtaaattcgattgtgaataggatgtattcac
作用机理：四环素类抗生素通过与细菌胞内核糖体 30S亚基形成可逆结合体，抑制蛋白质合成，起到抗菌效果。当抗生素浓度较低时，这种可逆的竞争性结合也将失去作用，细菌的蛋白质合成将继续进行。四环素还可通过结合线粒体70S亚基，抑制线粒体蛋白质的合成。四环素与真核细胞核糖体80S亚基的结合能力相对较弱，因此抑制真核细胞蛋白质合成的能力也较弱。这可能是四环素抗菌作用能力强，而对人类副作用小的原因。
大肠，枯草：50-100ug/mL
氨基糖苷抗生素[1]
是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。
有来自链霉菌的链霉素等、来自小单孢菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有阿米卡星等半合成氨基糖苷类。
抗性基因序列aph(4)-Ia
ttattcctttgccctcggacgagtgctggggcgtcggtttccactatcggcgagtacttctacacagccatcggtccagacggccgcgcttctgcgggcgatttgtgtacgcccgacagtcccggctccggatcggacgattgcgtcgcatcgaccctgcgcccaagctgcatcatcgaaattgccgtcaaccaagctctgatagagttggtcaagaccaatgcggagcatatacgcccggagccgcggcgatcctgcaagctccggatgcctccgctcgaagtagcgcgtctgctgctccatacaagccaaccacggcctccagaagaagatgttggcgacctcgtattgggaatccccgaacatcgcctcgctccagtcaatgaccgctgttatgcggccattgtccgtcaggacattgttggagccgaaatccgcgtgcacgaggtgccggacttcggggcagtcctcggcccaaagcatcagctcatcgagagcctgcgcgacggacgcactgacggtgtcgtccatcacagtttgccagtgatacacatggggatcagcaatcgcgcatatgaaatcacgccatgtagtgtattgaccgattccttgcggtccgaatgggccgaacccgctcgtctggctaagatcggccgcagcgatcgcatccatggcctccgcgaccggctgcagaacagcgggcagttcggtttcaggcaggtcttgcaacgtgacaccctgtgcacggcgggagatgcaataggtcaggctctcgctgaattccccaatgtcaagcacttccggaatcgggagcgcggccgatgcaaagtgccgataaacataacgatctttgtagaaaccatcggcgcagctatttacccgcaggacatatccacgccctcctacatcgaagctgaaagcacgagattcttcgccctccgagagctgcatcaggtcggagacgctgtcgaacttttcgatcagaaacttctcgacagacgtcgcggtgagttcaggctttttacccat
链霉素（streptomycin）
作用机理：可以与核酸强结合，干扰和阻断蛋白质合成，同时允许继续合成 RNA 和 DNA 。
耐药机理：阳性转化子转入磷酸转移酶（aminoglycoside phosphotransferase）基因（如：aph(4)-Ia），并进行表达后。磷酸转移酶能作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化。如卡那霉素激酶(编号：EC 2.7.1.95)催化ATP的γ磷酸转移至卡那霉素3′-羟基，产生3′-磷酸卡那霉素，也可作用于庆大霉素、新霉素等氨基糖苷抗生素，从而抑制其与核糖体结合失去抗菌活力。
低拷贝载体用25 mg/L；高拷贝载体用50 mg/L；菌株筛选用50 mg/L
诺尔斯菌素（Nourseothricin）
nat1 sequence 573bp
atgggtaccactcttgacgacacggcttaccggtaccgcaccagtgtcccgggggacgccgaggccatcgaggcactggatgggtccttcaccaccgacaccgtcttccgcgtcaccgccaccggggacggcttcaccctgcgggaggtgccggtggacccgcccctgaccaaggtgttccccgacgacgaatcggacgacgaatcggacgacggggaggacggcgacccggactcccggacgttcgtcgcgtacggggacgacggcgacctggcgggcttcgtggtcgtctcgtactccggctggaaccgccggctgaccgtcgaggacatcgaggtcgccccggagcaccgggggcacggggtcgggcgcgcgttgatggggctcgcgacggagttcgcccgcgagcggggcgccgggcacctctggctggaggtcaccaacgtcaacgcaccggcgatccacgcgtaccggcggatggggttcaccctctgcggcctggacaccgccctgtacgacggcaccgcctcggacggcgagcaggcgctctacatgagcatgccctgcccctaa
作用机理：代谢产生的一种广谱型抗生素，因结构上具链丝菌素（Streptothricin，STs）化学基团，故归属于此类抗生素亚家族。天然产物提取的诺尔斯菌素（Nourseothricin）一般为ST-F和ST-D的混合物，具有极其宽广的抑制生长活性，原核生物如细菌；真核生物如包括白色念球菌在内的各种酵母菌、丝状真菌、原生生物、昆虫和植物。诺尔斯菌素的作用机制是通过诱导mRNA错误编码，来抑制蛋白合成。
耐药机理：nat1最初从S. noursei分离所得，此基因能编码表达诺尔斯菌素N-乙酰转移酶，通过对诺尔斯菌素（NTC）上与糖基部分相连的ß-赖氨酸上的ß-氨基基团进行单乙酰化修饰，使得抗生素失活。
筛选浓度：大多数有机体的筛选浓度多在50-200µg/ml区间内。
氯霉素（chloramphenicol）
CmR chloramphenicol acetyltransferase
atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtctgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaa
作用机理：细菌细胞的70S核糖体是合成蛋白质的主要细胞成分，它包括50S和30S两个亚基。氯霉素通过可逆地与50S亚基结合，阻断转肽酰酶的作用，干扰带有氨基酸的胺基酰-tRNA终端与50S亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成。由于氯霉素还可与人体线粒体的70S结合，因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性。（做实验时请一定注意安全）
耐药机理：氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol Acetyltransferase ，CAT）是一种原核酶类，可以将氯霉素乙酰化而使其失活，是细菌产生氯霉素抗性的主要原因。
储存液制备：
称取1g氯霉素溶于20ml 100%乙醇充分溶解后得到50mg/ml的母液，0.22µM有机相滤膜过滤除菌后，分装成小量后-20°C冻存，避免反复冻融，一年有效。实际有效工作浓度为5-20µg/ml。
本文转自小林的实验方法记录本
转自：“医学科研小坑”微信公众号
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