作者：陈红玉、陆宗阳
对哺乳动物基因组进行精准基因整合是一项低效，但具有重要价值的工作。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑工具的出现，为制备精准基因编辑的动物模型提供了高效手段。CRISPR/Cas9系统利用Cas9核酸酶与单链导向RNA（sgRNA），通过有效诱导基因组中特定位点发生DNA双链断裂（DSB），使研究人员能够进行基因组编辑。DSB主要由非同源末端连接（NHEJ）、微同源末端连接（MMEJ）和同源重组（HDR）三种机制来修复。相比NHEJ和MMEJ修复途径在DSB位点进行不可预测的碱基插入或者删除，HDR通路可以利用与DSB位点周围区域具有同源序列的模板（内源性或外源性DNA）为供体模板，以精确重组的方式修复DNA，可以实现基因组DNA的精准基因插入、删除以及单个核苷酸的替换。因此，基于HDR的基因编辑方法为开发安全、高精度的人类疾病基因治疗方法提供了很大的便利。然而，在哺乳动物细胞基因组中，HDR修复效率非常低，这限制了精准编辑在哺乳动物细胞中的应用。
近年来，很多研究人员致力于提高HDR效率，主要从抑制NHEJ、激活HDR通路、控制细胞周期等方面[1-3]。近日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘真研究员、孙强研究员和陆宗阳博士后共同合作发现，MMEJ修复通路在CRISPR/Cas9介导的小鼠胚胎基因损伤修复中占有重要的比例，通过使用CasRX这一RNA基因编辑工具下调参与MMEJ修复的关键基因DNA聚合酶θ（polq），在小鼠胚胎以及其后代中显著提高了线性化双链DNA以及ssODN外源模板的基因敲入效率。这种基因敲入方法被称之为CATI（CasRX-assisted targeted integration）。利用CATI的方法也显著提升了食蟹猴胚胎基因敲入的效率。CATI策略为疾病动物模型的开发以及基因疾病的临床治疗提供了新的选择。
该研究首先设计了88条sgRNA，共靶标21个基因位点，将这些sgRNA分别注射到超过1500枚小鼠胚胎中，最后对单个胚胎进行Sanger测序，并分析sgRNA的编辑效率以及靶标位点的DNA修复模式。经分析发现sgRNA编辑的效率越高，MMEJ修复模式所占的比例越高，提示MMEJ在CRISPR/Cas9介导的小鼠胚胎基因编辑中发挥重要作用。随后，在对基因编辑的胚胎进行RNA-seq测序，研究人员发现，外源DNA模板的存在会诱导MMEJ修复的核心机器polq的基因表达上升（图1）。MMEJ和HDR这两种修复之间存在竞争，这就暗示了可以通过抑制polq的表达来抑制MMEJ在修复过程中的比重，进而增大HDR修复的比例。
图1 MMEJ修复途径在CRISPR/Cas9介导的小鼠胚胎DSB损伤修复发挥重要功能。
为了验证这个想法，该研究分别测试了siRNA和CasRX工具在小鼠胚胎中的基因敲低表现，结果表明靶向RNA的新型基因编辑工具CasRX效果远好于传统的siRNA。通过结合Cas9介导的基因敲入和CasRX介导的Polq基因敲低，作者成功在小鼠Actb和Gata6位点上实现了基因敲入效率的提升，把该方法命名为CATI（CasRX-assisted targeted integration）。CATI在另外测试的12个位点中成功提升了敲入效率，其中3个位点的胚胎通过胚胎移植获得了基因敲入小鼠，这些小鼠敲入的基因型可以被传递到下一代，证明了CATI在动物模型构建中的应用潜力（图2）。
图2 CATI策略能有效提升胚胎以及动物的基因敲入效率。
过去有大量的工作报道了不同的提升基因敲入效率的策略，该研究以杨辉老师提出的线性化供体模板为基础[4]，在小鼠胚胎水平上，整体比较分析了10种具有代表性的方法。研究发现先，只有二细胞时期胚胎注射策略[5]可以被稳定重复，在与CATI策略结合后可以进一步提升敲入效率，Actb位点的敲入效率最高达到了91.3%。此外，CATI在非人灵长类胚胎中同样可以提升效率，在测试的CDX2位点上，敲入效率从37.9%提升到64.9%，在H3.3B位点上从50.8%提升到74.5%（图3）。
图3 CATI策略与二细胞策略联合使用高效提升基因敲入效率。
单链寡核苷酸（ssODN）做为另一种常用的外源整合模板被广泛的用于CRISPR介导的精准基因修饰中，研究发现CATI同样适用于ssODN策略。在构建Sod1疾病相关位点突变的实验中，CATI组小鼠携带的目的突变均显著高于对照组，并且作者发现利用CATI技术的样本携带更少的Indel和MMEJ模式的修复，这些结果与CATI策略的原理一致（图4）。
图4 CATI策略能高效提升ssODN基因敲入的效率。
最后，作者对CATI进行了全面的安全性评估。GOTI实验表明CATI技术并不会引入更多的突变和基于Cas9的脱靶。通过对全基因组进行整合序列分析，发现CATI同样不会引入更多的外源DNA模板的随机整合。对编辑位点附近序列进行三代测序后发现，CATI可以有效减少大片段的缺失。考虑到Polq蛋白本身的功能，在使用CATI的过程中可以抑制大片段丢失并不意外（图5）。
图5 GOTI实验证明CATI策略既有较低的基因脱靶，大片段随机整合以及大片段缺失的风险。
总的来说，该研究发现了胚胎中CRISPR介导的高效基因编辑过程中造成的DNA损伤修复的规律，即MMEJ修复占更大的比例。通过这一发现作者巧妙的将DNA编辑工具和RNA编辑工具联合使用（CATI策略），在基因敲入的过程中抑制Polq的表达就可以显著提高敲入效率（图6）。研究随后不仅证明这个策略在小鼠和非人灵长类胚胎中通用，并发现CATI在不引入更多的脱靶和突变的情况下，可以显著降低大片段的丢失。为疾病动物模型的开发以及基因疾病的临床治疗提供了新的选择。
图6 CATI策略的原理图。
参考文献：
1. Ma M, Zhuang F, Hu X, Wang B, Wen XZ, Ji JF, Xi JJ: Efficient generation of mice carrying homozygous double-floxp alleles using the Cas9-Avidin/Biotin-donor DNA system. Cell Res 2017, 27:578-581.
2. Zhao Z, Shang P, Sage F, Geijsen N: Ligation-assisted homologous recombination enables precise genome editing by deploying both MMEJ and HDR.Nucleic Acids Res 2022.
3. Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, et al: Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.Genome Biol 2017, 18:92.
4. Yao X, Zhang M, Wang X, Ying W, Hu X, Dai P, Meng F, Shi L, Sun Y, Yao N, et al: Tild-CRISPR Allows for Efficient and Precise Gene Knockin in Mouse and Human Cells. Dev Cell 2018, 45:526-536 e525.
5. Gu B, Posfai E, Rossant J: Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos. Nat Biotechnol 2018, 36:632-637.
上述研究结果已于近日在Genome Biology在线发表，题目为“CATI: an efficient gene integration method for rodent and primate embryos by MMEJ suppression”。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘真研究员、孙强研究员与陆宗阳博士为通讯作者，陈红玉博士为第一作者，博士研究生刘星辰和硕士研究生李兰心为共同第一作者。
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CATI: an efficient gene integration method for rodent and primate embryos by MMEJ suppression
转自：“BMC科研永不止步”微信公众号
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