实验|聚合酶链式反应原理及步骤

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聚合酶链式反应

简称PCR（Polymerase Chain Reaction）（又称：多聚酶链式反应）。

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。

PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

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原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR是一种体外DNA 扩增技术，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3，末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增，从而在短时间内使DNA片段在数量上呈指数增加。

图1 PCR原理示意图（来源：百度）

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步骤

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

（1）模板DNA的变性

模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

（2）模板DNA与引物的退火（复性）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

（3）引物的延伸

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

图2 PCR扩增流程图（来源：百度）

注：参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。

来源：每日生物评论

转自：“斐然智达SCI学术服务”微信公众号

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